發(fā)布時(shí)間：2019-01-30 09:08

【摘要】：背景神經(jīng)病理性疼痛(Neuropathicpain,NPP)定通常指中樞或外周神經(jīng)系統(tǒng)的損壞及功能失調(diào)引起的異常疼痛,NPP屬于慢性疼痛的一種,主要臨床表現(xiàn)為痛覺過敏、感覺異常、自發(fā)性疼痛和異常疼痛等。其發(fā)病率高,疼痛治療的整體效果不佳,因此探究神經(jīng)性疼痛的發(fā)病機(jī)制,為疼痛治療提供可靠依據(jù)將具有重要醫(yī)學(xué)價(jià)值。糖皮質(zhì)激素受體(Glucocorticoid receptor,GR)是重要的核轉(zhuǎn)錄因子。GR激活后進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)與特定的DNA序列(糖皮質(zhì)激素反應(yīng)元件)結(jié)合在一起,進(jìn)而正調(diào)控或負(fù)調(diào)控靶基因的表達(dá),參與不同的生物效應(yīng)和多種生理、病理過程[1,2]。近年來,越來越多證據(jù)表明中樞糖皮質(zhì)激素受體GR可能參與中樞痛敏形成及傷害性信息的傳遞,但具體機(jī)制不明確[3,4]。眾所周知,中樞活化的小膠質(zhì)細(xì)胞通過合成與釋放疼痛及炎性相關(guān)介質(zhì)(如COX 2、IL-6、TNF-α等),作用于神經(jīng)元或者鄰近的膠質(zhì)細(xì)胞,近而增強(qiáng)痛覺傳遞神經(jīng)元敏感性和反應(yīng)性,引發(fā)持續(xù)性的神經(jīng)病理性疼痛。已有報(bào)道證實(shí)GR廣泛表達(dá)與中樞神經(jīng)系統(tǒng),并且可參與免疫炎癥反應(yīng),那么神經(jīng)病理性疼痛中,GR與活化的小膠質(zhì)細(xì)胞中有怎樣的作用關(guān)系呢?研究發(fā)現(xiàn)神經(jīng)損傷誘發(fā)的異常性疼痛依賴于p38 MAPK信號(hào)通路,并且活化的p38 MAPK僅表達(dá)在激活的小膠質(zhì)細(xì)胞[5]。本實(shí)驗(yàn)擬通過坐骨神經(jīng)分支選擇性損傷模型(sparednerve injury,SNI)早期鞘內(nèi)給予p38 MAPK抑制劑,檢測(cè)神經(jīng)病理性疼痛中小膠質(zhì)細(xì)胞p38 MAPK信號(hào)通路對(duì)GR的調(diào)控。然后再給予GR的抑制劑,用于探索GR對(duì)下游轉(zhuǎn)錄因子核因子κB(NF-κB)及促炎因子的調(diào)控。由此重點(diǎn)研究GR參與神經(jīng)損傷誘導(dǎo)的神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制,為神經(jīng)病理性疼痛的治療提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。目的(1)建立SNI大鼠神經(jīng)病理性疼痛模型,觀察SNI術(shù)后大鼠脊髓機(jī)械痛行為和脊髓GR蛋白表達(dá)變化。(2)通過蛛網(wǎng)膜下腔注射SB203580阻斷p38MAPK通路,利用RU38486抑制掉GR的功能,分別檢測(cè)給藥后機(jī)械痛行為和GR、磷酸化NF-κB(p NF-κB)的表達(dá)變化。以此探索神經(jīng)病理性疼痛中p38MAPK信號(hào)通路通對(duì)GR和p NF-κB的調(diào)控。(3)鞘內(nèi)給予GR的激動(dòng)劑DEX,檢測(cè)SNI大鼠痛行為的變化及p NF-κB表達(dá)變化,進(jìn)一步驗(yàn)證在神經(jīng)病理性疼痛中GR對(duì)下游轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的調(diào)控。材料和方法(1)建立SNI大鼠動(dòng)物模型[6],檢測(cè)模型的成功及大鼠脊髓GR蛋白變化將實(shí)驗(yàn)用大鼠按照隨機(jī)表法分組,每組12只:正常組(normal組),手術(shù)模型組(SNI組),假手術(shù)對(duì)照組(sham組),SB203580注藥組(SNI+SB203580組),單純?nèi)苜|(zhì)組(SNI+Vehicle組,n=12);假手術(shù)注射溶劑組(sham+Vehicle組),模型組給予溶劑組(SNI+Vehicle組,n=10)SB203580和RU38486聯(lián)合注藥組(SNI+SB203580+RU38486),地塞米松處理組(SNI+DEX組)。手術(shù)組剝離皮下組織,使坐骨神經(jīng)及三個(gè)分支充分暴露,分別從兩端結(jié)扎腓總神經(jīng)、脛神經(jīng)并剪掉兩個(gè)結(jié)扎位點(diǎn)中間部分。sham組只暴露坐骨神經(jīng),而不做結(jié)扎處理。Von frey檢測(cè)大鼠機(jī)械痛時(shí)程變化,確定模型成功;酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)(ELisa)檢測(cè)大鼠血漿皮質(zhì)酮的變化;Western-blot檢測(cè)大鼠脊髓GR、磷酸化p38(p-p38)和磷酸化NF-κB(p NF-κB)的表達(dá);免疫熒光化學(xué)檢測(cè)脊髓GR與小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物是否共標(biāo)。(2)檢測(cè)神經(jīng)病理性疼痛中p38對(duì)GR的調(diào)控術(shù)后早期通過蛛網(wǎng)膜下腔注射SB203580阻斷p38MAPK通路,檢測(cè)對(duì)大鼠機(jī)械痛行為影響;Western-blot和免疫熒光技術(shù)檢測(cè)下游轉(zhuǎn)錄因子p NF-κB表達(dá)變化;ELisa檢測(cè)大鼠血清促炎因子IL-6、TNF-α的變化。在此基礎(chǔ)給予RU38486抑制掉GR的功能,觀察該現(xiàn)象是否被GR受體阻滯劑RU38486逆轉(zhuǎn)。(3)檢測(cè)神經(jīng)病理性疼痛中GR對(duì)磷酸化NF-κB的調(diào)控SNI術(shù)后立即通過蛛網(wǎng)膜下腔注射DEX激活GR的表達(dá),檢測(cè)機(jī)械痛行為及p NF-κB和促炎因子IL-6、TNF-α的變化,行為學(xué)觀察激活GR后是否逆轉(zhuǎn)了神經(jīng)損傷誘導(dǎo)的痛行為,Western-blot和ELisa分別檢測(cè)p NF-κB和促炎因子IL-6、TNF-α的改變。結(jié)果1.SNI動(dòng)物模型制作成功。與sham組相比,SNI模型組大鼠術(shù)后3d、7d、14d、21d和28d時(shí)間點(diǎn),機(jī)械痛閾降低,模型建立成功。Western-blot檢測(cè)與sham組相比,SNI組脊髓GR表達(dá)逐漸降低,p-p38和p NF-κB表達(dá)增加。免疫熒光雙標(biāo)技術(shù)檢測(cè)GR在小膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞均有表達(dá)。2.Western-blot,免疫熒光結(jié)果顯示:SNI大鼠術(shù)后立即連續(xù)7 d鞘內(nèi)注射SB203580后,大鼠脊髓p-p38、p NF-κB表達(dá)降低,而GR表達(dá)水平提高,Elisa檢測(cè)到血清促炎因子水平降低;而鞘內(nèi)注射RU38486抑制GR的表達(dá),結(jié)果逆轉(zhuǎn)了SNI+SB203580組疼痛緩解的局勢(shì)及p NF-κB和促炎因子IL-6、TNF-α高表達(dá)的現(xiàn)象。3.SNI大鼠于術(shù)后早期鞘內(nèi)注射DEX上調(diào)GR的表達(dá),結(jié)果顯示與未給藥SNI組相比,SNI+DEX組大鼠疼痛緩解,脊髓p NF-κB的表達(dá)增高,促炎因子IL-6、TNF-α的表達(dá)降低。Western-blot,免疫熒光結(jié)果顯示GR負(fù)調(diào)控p NF-κB的表達(dá)。結(jié)論1.在神經(jīng)病理性疼痛的早期中,脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞p38MAPK信號(hào)通路活化通過下調(diào)GR的表達(dá)促進(jìn)疼痛的發(fā)生、發(fā)展。2.在神經(jīng)病理性疼痛中,激活的GR能夠通過抑制脊髓NF-κB的磷酸化及促炎因子IL-6和TNF-α的表達(dá)水平而緩解疼痛。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R402

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本文編號(hào)：2417977