【摘要】：背景神經(jīng)病理性疼痛(Neuropathicpain,NPP)定通常指中樞或外周神經(jīng)系統(tǒng)的損壞及功能失調(diào)引起的異常疼痛,NPP屬于慢性疼痛的一種,主要臨床表現(xiàn)為痛覺過敏、感覺異常、自發(fā)性疼痛和異常疼痛等。其發(fā)病率高,疼痛治療的整體效果不佳,因此探究神經(jīng)性疼痛的發(fā)病機制,為疼痛治療提供可靠依據(jù)將具有重要醫(yī)學價值。糖皮質(zhì)激素受體(Glucocorticoid receptor,GR)是重要的核轉(zhuǎn)錄因子。GR激活后進入細胞核內(nèi)與特定的DNA序列(糖皮質(zhì)激素反應元件)結(jié)合在一起,進而正調(diào)控或負調(diào)控靶基因的表達,參與不同的生物效應和多種生理、病理過程[1,2]。近年來,越來越多證據(jù)表明中樞糖皮質(zhì)激素受體GR可能參與中樞痛敏形成及傷害性信息的傳遞,但具體機制不明確[3,4]。眾所周知,中樞活化的小膠質(zhì)細胞通過合成與釋放疼痛及炎性相關(guān)介質(zhì)(如COX 2、IL-6、TNF-α等),作用于神經(jīng)元或者鄰近的膠質(zhì)細胞,近而增強痛覺傳遞神經(jīng)元敏感性和反應性,引發(fā)持續(xù)性的神經(jīng)病理性疼痛。已有報道證實GR廣泛表達與中樞神經(jīng)系統(tǒng),并且可參與免疫炎癥反應,那么神經(jīng)病理性疼痛中,GR與活化的小膠質(zhì)細胞中有怎樣的作用關(guān)系呢?研究發(fā)現(xiàn)神經(jīng)損傷誘發(fā)的異常性疼痛依賴于p38 MAPK信號通路,并且活化的p38 MAPK僅表達在激活的小膠質(zhì)細胞[5]。本實驗擬通過坐骨神經(jīng)分支選擇性損傷模型(sparednerve injury,SNI)早期鞘內(nèi)給予p38 MAPK抑制劑,檢測神經(jīng)病理性疼痛中小膠質(zhì)細胞p38 MAPK信號通路對GR的調(diào)控。然后再給予GR的抑制劑,用于探索GR對下游轉(zhuǎn)錄因子核因子κB(NF-κB)及促炎因子的調(diào)控。由此重點研究GR參與神經(jīng)損傷誘導的神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)生發(fā)展的分子機制,為神經(jīng)病理性疼痛的治療提供新的實驗依據(jù)。目的(1)建立SNI大鼠神經(jīng)病理性疼痛模型,觀察SNI術(shù)后大鼠脊髓機械痛行為和脊髓GR蛋白表達變化。(2)通過蛛網(wǎng)膜下腔注射SB203580阻斷p38MAPK通路,利用RU38486抑制掉GR的功能,分別檢測給藥后機械痛行為和GR、磷酸化NF-κB(p NF-κB)的表達變化。以此探索神經(jīng)病理性疼痛中p38MAPK信號通路通對GR和p NF-κB的調(diào)控。(3)鞘內(nèi)給予GR的激動劑DEX,檢測SNI大鼠痛行為的變化及p NF-κB表達變化,進一步驗證在神經(jīng)病理性疼痛中GR對下游轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的調(diào)控。材料和方法(1)建立SNI大鼠動物模型[6],檢測模型的成功及大鼠脊髓GR蛋白變化將實驗用大鼠按照隨機表法分組,每組12只:正常組(normal組),手術(shù)模型組(SNI組),假手術(shù)對照組(sham組),SB203580注藥組(SNI+SB203580組),單純?nèi)苜|(zhì)組(SNI+Vehicle組,n=12);假手術(shù)注射溶劑組(sham+Vehicle組),模型組給予溶劑組(SNI+Vehicle組,n=10)SB203580和RU38486聯(lián)合注藥組(SNI+SB203580+RU38486),地塞米松處理組(SNI+DEX組)。手術(shù)組剝離皮下組織,使坐骨神經(jīng)及三個分支充分暴露,分別從兩端結(jié)扎腓總神經(jīng)、脛神經(jīng)并剪掉兩個結(jié)扎位點中間部分。sham組只暴露坐骨神經(jīng),而不做結(jié)扎處理。Von frey檢測大鼠機械痛時程變化,確定模型成功;酶聯(lián)免疫吸附檢測(ELisa)檢測大鼠血漿皮質(zhì)酮的變化;Western-blot檢測大鼠脊髓GR、磷酸化p38(p-p38)和磷酸化NF-κB(p NF-κB)的表達;免疫熒光化學檢測脊髓GR與小膠質(zhì)細胞標記物是否共標。(2)檢測神經(jīng)病理性疼痛中p38對GR的調(diào)控術(shù)后早期通過蛛網(wǎng)膜下腔注射SB203580阻斷p38MAPK通路,檢測對大鼠機械痛行為影響;Western-blot和免疫熒光技術(shù)檢測下游轉(zhuǎn)錄因子p NF-κB表達變化;ELisa檢測大鼠血清促炎因子IL-6、TNF-α的變化。在此基礎(chǔ)給予RU38486抑制掉GR的功能,觀察該現(xiàn)象是否被GR受體阻滯劑RU38486逆轉(zhuǎn)。(3)檢測神經(jīng)病理性疼痛中GR對磷酸化NF-κB的調(diào)控SNI術(shù)后立即通過蛛網(wǎng)膜下腔注射DEX激活GR的表達,檢測機械痛行為及p NF-κB和促炎因子IL-6、TNF-α的變化,行為學觀察激活GR后是否逆轉(zhuǎn)了神經(jīng)損傷誘導的痛行為,Western-blot和ELisa分別檢測p NF-κB和促炎因子IL-6、TNF-α的改變。結(jié)果1.SNI動物模型制作成功。與sham組相比,SNI模型組大鼠術(shù)后3d、7d、14d、21d和28d時間點,機械痛閾降低,模型建立成功。Western-blot檢測與sham組相比,SNI組脊髓GR表達逐漸降低,p-p38和p NF-κB表達增加。免疫熒光雙標技術(shù)檢測GR在小膠質(zhì)細胞、神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細胞均有表達。2.Western-blot,免疫熒光結(jié)果顯示:SNI大鼠術(shù)后立即連續(xù)7 d鞘內(nèi)注射SB203580后,大鼠脊髓p-p38、p NF-κB表達降低,而GR表達水平提高,Elisa檢測到血清促炎因子水平降低;而鞘內(nèi)注射RU38486抑制GR的表達,結(jié)果逆轉(zhuǎn)了SNI+SB203580組疼痛緩解的局勢及p NF-κB和促炎因子IL-6、TNF-α高表達的現(xiàn)象。3.SNI大鼠于術(shù)后早期鞘內(nèi)注射DEX上調(diào)GR的表達,結(jié)果顯示與未給藥SNI組相比,SNI+DEX組大鼠疼痛緩解,脊髓p NF-κB的表達增高,促炎因子IL-6、TNF-α的表達降低。Western-blot,免疫熒光結(jié)果顯示GR負調(diào)控p NF-κB的表達。結(jié)論1.在神經(jīng)病理性疼痛的早期中,脊髓小膠質(zhì)細胞p38MAPK信號通路活化通過下調(diào)GR的表達促進疼痛的發(fā)生、發(fā)展。2.在神經(jīng)病理性疼痛中,激活的GR能夠通過抑制脊髓NF-κB的磷酸化及促炎因子IL-6和TNF-α的表達水平而緩解疼痛。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：鄭州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R402

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本文編號：2417977