【摘要】：研究目的:造血干細胞移植(hematopoietic stem cell transplantation,HSCT)在血液系統(tǒng)惡性疾病和非血液系統(tǒng)疾病中有著廣泛應用,但移植后的移植物抗宿主病(GVHD)仍是移植相關死亡的首要原因,限制了其應用。早在1966年Billingham提出了GVHD發(fā)病的三個要素:(1)移植物中含免疫活性細胞;(2)受體表達供體沒有的組織抗原;(3)受體處于免疫抑制狀態(tài)不能排斥移植物。大量研究發(fā)現(xiàn),雖然去除移植物中的T細胞或抑制其功能均能使GVHD的發(fā)生率或其嚴重程度降低,但卻增加了機會性感染及復發(fā)的幾率。近幾年,具有免疫調節(jié)作用的細胞調控GVHD成為新的研究熱點,如間充質干細胞、NK細胞、NK T細胞、CD4+CD25+Tregs等,它們通過抑制供者的同種反應性T細胞對非己抗原的免疫攻擊,從而使GVHD的發(fā)生降低,但是上述細胞的缺點是它們的獲得、擴增等均需要特殊的條件及設備,限制了其在臨床中廣泛應用。另外一些研究報導,受者自身的某些細胞如骨髓細胞、外周血單個核細胞、脾細胞同樣可以有效地降低GVHD的發(fā)生,而具有取材方便、易于獲得、安全性高、便于直接應用等優(yōu)點的受者淋巴細胞受到人們重視。本實驗旨在研究MHC半相合小鼠造血干細胞移植后,不同時間輸注不同數(shù)量的受者脾細胞,對GVHD的產生、發(fā)展的影響,并進一步的探討其可能機制。研究內容:1,MHC半相合小鼠造血干細胞移植GVHD模型的建立2,移植后不同時間輸注不同數(shù)量的受者脾細胞對植入及GVHD發(fā)生的影響3,移植后+4d輸注受者脾細胞3×107,降低GVHD發(fā)生率的機制探討研究方法:1.MHC半相合小鼠造血干細胞移植GVHD模型的建立將受體小鼠根據(jù)輸注細胞數(shù)量的不同隨機分為4組,每組用8只小鼠。將實驗分為A組:單純8Gy TBI預處理。B、C、D三組:預處理相同(8Gy TBI照射),分別輸注供鼠脾細胞量為1×107、3×107、6×107,A組僅輸注等量的生理鹽水。在移植后,監(jiān)控造血恢復情況、供體嵌合情況、受鼠的體征變化及組織病理學改變,并進行GVHD的評分和診斷。2.移植后不同時間輸注不同數(shù)量的受者脾細胞對植入及GVHD發(fā)生率的影響根據(jù)移植后的時間及輸注受者細胞的數(shù)量,將實驗分組為(1)移植后+1d輸注組:在移植后+1d(以移植C57BL/6動員后脾細胞輸注當天,作為第0天,下同)給予受鼠脾數(shù)量分別為1×107、3×107、6×107,對照組輸注等量生理鹽水。(2)移植后+4d輸注組:在移植后+4d給予受鼠脾細胞數(shù)量分別為1×107、3×107、6×107,對照組輸注等量生理鹽水。(3)移植后+7d輸注組:在移植后+7d輸注受鼠脾細胞數(shù)量分別為1×107、3×107、6×107,對照組輸注等量生理鹽水。在移植后監(jiān)控造血恢復情況、供體嵌合情況、受鼠的體征變化及組織病理學改變,并進行GVHD的評分及診斷。3.移植后+4d輸注受者脾細胞3×107,降低GVHD發(fā)生率的機制探討在移植后+1d、+4d、+7d輸注等量受者細胞3×107,在移植后,監(jiān)控外周血的淋巴亞群比例變化和T淋巴細胞FasL的表達變化。研究結果:1,受鼠CB6F1給予8Gy TBI預處理,輸注MHC半相合親代供鼠C57經G-CSF動員后的脾臟單個核細胞,在輸注細胞數(shù)量為1×107時,雖然受鼠能達到完全供者嵌合狀態(tài),但GVHD發(fā)生率僅為50%。而在輸注細胞數(shù)量為3×107、6×107時,受鼠均能夠形成完全供者嵌合,其GVHD發(fā)生率為100%,受鼠脾臟、小腸、皮膚、肝臟的病理結果呈現(xiàn)出典型的GVHD病理改變,表明成功的建立了H-2半相合小鼠Allo-HSCT移植物抗宿主病動物模型。2,在移植后+1d分別輸注受者細胞數(shù)量為1×107、3×107的移植組,供體均獲得完全嵌合狀態(tài)(complete chimerism,CC),其GVHD發(fā)生率和死亡率均為100%,中位生存時間為18d~21d,而輸注6×107組,卻導致了移植排斥,移植受鼠全部因造血衰竭而死亡,中位生存時間為14d;在移植后+7d時,分別輸注受者細胞量1×107、3×107、6×107的移植組,供體均獲得CC,其GVHD發(fā)生率和死亡率均為100%,中位生存時間為23d~28d;而在移植后+4d時輸注受者細胞量為3×107、6×107的移植組,供體均獲得CC,其GVHD發(fā)生率在20%~30%,顯著降低了GVHD的發(fā)生率,中位生存時間60d,顯著延長受者存活時間;而在移植后+4d時輸注1×107組,GVHD的發(fā)生率為80%,中位生存時間為45d。3,在正常供鼠(C57)中,CD3+CD4+FasL、CD3+CD8+FasL的表達率分別為(0.3±0.06)%、(0.4±0.11)%。在移植后+10d,陽性對照組(8Gy TBI輸注供者細胞3×107)中外周血供者CD3+CD4+FasL、CD3+CD8+FasL的表達率為(72.12±19.05)%、(36.23±15.73)%,顯著高于正常供鼠的表達(P0.05)。而在+4d輸注組(移植后+4d輸注受者細胞3×107)中CD3+CD4+FasL、CD3+CD8+FasL的表達率分別為(10.14±7.26)%、(6.12±5.75)%,顯著低于陽性對照組,具有統(tǒng)計學差異(P0.01),與+1d輸注組(移植后+1d輸注受者細胞3×107):CD3+CD4+FasL:(51.52±11.12)%、CD3+CD8+FasL:(13.13±3.35)%比較P0.05,與+7d輸注組(移植后+7d輸注受者細胞3×107):CD3+CD4+FasL:(68.16±13.25)%、CD3+CD8+FasL:(36.14±9.64)%比較P0.01,具有顯著性差異。研究結論:1,本研究成功建立了H-2半相合小鼠移植GVHD動物模型,為進一步研究GVHD的機制提供了理想的平臺;2,在MHC半相合小鼠造血干細胞移植后+4d時輸注受者細胞能顯著降低GVHD發(fā)生率,延長生存時間;而在移植后+1d、+7d時,并不能降低GVHD發(fā)生率。3,MHC半相合小鼠造血干細胞移植后輸注受者脾細胞,輸注的時間不同,會導致T淋巴細胞的表面FasL的表達呈現(xiàn)出不同的狀態(tài)。受者細胞在移植后+4d輸注比+1d、+7d輸注能更明顯的降低T淋巴細胞FasL的表達。
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【學位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R457.7

【參考文獻】

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本文編號：2256466