本文選題：銅綠假單胞菌 + 亞麻酸　； 參考：《大連醫(yī)科大學(xué)》2017年碩士論文

【摘要】：背景:自然界中的微生物為人類帶來了有利同時(shí)又有害的影響。其有利的一面源于人類與微生物界的共生關(guān)系。然而人類一些疾病的發(fā)生使得看似“友善”的微生物成為了會導(dǎo)致人類許多微生物相關(guān)疾病的條件致病菌。許多細(xì)菌通過產(chǎn)生生物膜來抵御不利的生存環(huán)境,這是其中一種防御機(jī)制。生物膜的形成是一個(gè)主動過程,主要取決于當(dāng)環(huán)境信號刺激細(xì)胞進(jìn)入周期增長階段的時(shí)間,并且生物膜的形成過程是由一系列由群體感應(yīng)系統(tǒng)(QS)支配的基因調(diào)控的。另外,生物膜結(jié)構(gòu)因多糖、蛋白質(zhì)、脂類及胞外DNA等大分子物質(zhì)的存在而被強(qiáng)化,這些物質(zhì)使得微生物能抵抗殺菌藥物。銅綠假單胞菌,一種廣泛存在于自然界中的革蘭陰性的條件致病菌,是醫(yī)院內(nèi)感染的主要病原菌之一。銅綠假單胞菌有三種相關(guān)的群體感應(yīng)系統(tǒng)(QS),通過這些群體感應(yīng)系統(tǒng),調(diào)控一些毒力因子的產(chǎn)生,從而導(dǎo)致銅綠假單胞菌引起人類嚴(yán)重威脅生命的感染,這迫使臨床醫(yī)生大量使用抗生素來應(yīng)對這些感染疾病,從而出現(xiàn)了多重耐藥菌株。近年來,臨床上常用妥布霉素治療由銅綠假單胞菌引起的肺部感染,但是銅綠假單胞菌也產(chǎn)生了對妥布霉素的抗藥性。目前通過研發(fā)和使用抗生素來治療這些感染,盡管大量關(guān)于藥物開發(fā)的研究都致力于減少微生物的耐藥性,但是某些特定抗菌化合物的毒性和耐受性問題以及微生物的持續(xù)進(jìn)化給研發(fā)帶來很多困難,這些迫使研究者關(guān)注和篩選天然植物化學(xué)成分和膳食成分作為抗菌藥物。脂肪酸是人體營養(yǎng)的重要組成部分,在人體生長過程中扮演十分重要的角色。脂肪酸作為活性物質(zhì)和藥物載體應(yīng)用在制藥行業(yè),例如脂質(zhì)體制劑以及ω-3脂肪酸在脂質(zhì)異常、糖尿病、癌癥以及抗炎和免疫調(diào)節(jié)活動中的作用,使得人們開始利用以及評估它在微生物相關(guān)傳染病中的價(jià)值,盡管它有不利的一面,但它可能對人類健康有更多有益的價(jià)值。在細(xì)菌中,游離脂肪酸通過多種方式首先作用于細(xì)菌細(xì)胞膜,使細(xì)菌繁殖受阻或引起類細(xì)胞凋亡樣的殺菌效應(yīng)。這些游離脂肪酸有必需脂肪酸,例如亞油酸和亞麻酸,人體不能合成,但可以通過營養(yǎng)和膳食補(bǔ)充劑獲得。亞麻酸連同其ω-3脂肪酸衍生物具有抗多種微生物的能力。所以我們推斷亞麻酸也能具備抗銅綠假單胞菌生物膜,并能提高妥布霉素的藥效。方法:為了證明這一猜想,本研究主要觀察亞麻酸及妥布霉素對銅綠假單胞菌臨床分離株、環(huán)境分離株和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)株(ATCC 27853)的影響。采用結(jié)晶紫染色檢測生物膜生物量厚度的差異來評估生物膜的形成。生物膜越厚,吸收的染液越多,與對照組相比,如果染色越輕,說明是由藥物抑制作用引起的。由于染色法不能區(qū)分附著在生物膜上的活細(xì)胞和死細(xì)胞,我們采用Alarma Blue法來測定生物膜代謝活性,去更好地解釋亞麻酸或妥布霉素的作用。此外,我們用熒光顯微鏡觀察生物膜生物量的變化。由于生物膜的形成由群體感應(yīng)系統(tǒng)控制,我們通過實(shí)時(shí)定量PCR檢測了選擇性群體感應(yīng)、生物膜和毒力因子相關(guān)基因的表達(dá)水平。另一方面,銅綠假單胞菌產(chǎn)生的多種毒力因子會導(dǎo)致宿主組織損傷,因此我們也檢測了QS相關(guān)毒力因子如群集運(yùn)動、綠膿菌素、Las A活性以及偶氮酪蛋白酶的表達(dá)情況,從而確認(rèn)亞麻酸或聯(lián)合妥布霉素是否可以減少這些毒性表型特征的產(chǎn)生從而減輕了銅綠假單胞菌的毒性。結(jié)果:實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)亞麻酸和妥布霉素對這些銅綠假單胞菌菌株的中位最小抑菌濃度分別是1.56mg/ml和0.3125mg/ml,其中一株臨床分離株C2對最小抑菌亞濃度為0.078mg/ml的妥布霉素顯示出抵抗,因此采用此株菌來研究在不受妥布霉素影響下,最小抑菌亞濃度的亞麻酸對細(xì)菌的作用效果。在單獨(dú)使用亞麻酸以及聯(lián)合使用妥布霉素會破壞銅綠假單胞菌生物膜的形成,減少生物膜細(xì)胞的代謝活動。在動力試驗(yàn)中,與未處理對照組相比,使用最大藥物劑量能進(jìn)一步阻止群集運(yùn)動。亞麻酸也可以減少綠膿菌素的產(chǎn)生以及降低偶氮酪蛋白的活性,并具有劑量依賴性,而妥布霉素不然。同樣也發(fā)現(xiàn)Las A活性受到抑制�；虮磉_(dá)分析結(jié)果也證實(shí)聯(lián)合使用亞麻酸和妥布霉素會下調(diào)銅綠假單胞菌群體感應(yīng)系統(tǒng)、生物膜和毒力因子相關(guān)基因的表達(dá)。藥物相互作用分析結(jié)果也證實(shí)了這種協(xié)同作用。結(jié)論:因此,亞麻酸可以抑制銅綠假單胞菌生物膜的形成從而可以成為一種潛在的輔助藥物。這種聯(lián)合療法能夠降低妥布霉素的藥用劑量從而減少氨基糖苷類抗生素對人體的負(fù)面影響,這為未來治療和控制銅綠假單胞菌的感染奠定堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。
[Abstract]:Background: the microbes in nature bring the beneficial and harmful effects of human beings. Their beneficial side is derived from the symbiotic relationship between human and microbial communities. However, the occurrence of some human diseases makes the seemingly "friendly" microbes become the conditional pathogenic bacteria that cause many human microbes to be related to diseases. The formation of the biofilm is an active process, mainly depending on the time when the environmental signal stimulates the cell to enter the period of growth, and the formation of the biofilm is regulated by a series of genes controlled by the QS. The membrane structure is strengthened by the presence of macromolecules such as polysaccharides, proteins, lipids and extracellular DNA, which make microbes resistant to bactericidal drugs. Pseudomonas aeruginosa, a gram-negative conditional pathogenic bacteria widely found in nature, is one of the main pathogens in hospital infection. There are three phases of Pseudomonas aeruginosa. The QS, which regulates the production of some virulence factors through these quorum sensing systems, leads to a serious threat to life by Pseudomonas aeruginosa, which compels clinicians to use antibiotics to cope with these infections, thus producing multidrug resistant strains. Mycophentin is a treatment for pulmonary infection caused by Pseudomonas aeruginosa, but Pseudomonas aeruginosa has also produced resistance to tobramycin. Currently, these infections are treated by development and use of antibiotics, although a large number of studies on drug development are committed to reducing microbial resistance, but the toxicity of certain specific antibacterial compounds The problem of tolerance and the continuous evolution of microbes have brought many difficulties to research and development, which compel researchers to focus on and screen the chemical constituents and dietary ingredients of natural plants as an antiseptic. Fatty acids are an important part of human nutrition and play an important role in the growth of human body. Fatty acids are used as active substances and as active substances. The use of drug carriers, such as liposomes, and omega -3 fatty acids, in lipid abnormalities, diabetes, cancer, and anti-inflammatory and immunomodulatory activities, makes people start to use and assess the value of it in microbiological related infectious diseases, although it has a negative side, but it may have more human health. The value of benefit. In bacteria, free fatty acids first act in the bacterial cell membrane in a variety of ways, causing bacterial resistance to obstruct or induce apoptosis like effects. These free fatty acids have essential fatty acids, such as linoleic acid and linolenic acid, which can not be synthesized by human body, but can be obtained by nutrition and dietary supplements. Linolenic acid can be obtained. The same Omega -3 fatty acid derivatives have the ability to resist a variety of microorganisms. Therefore, we infer that linolenic acid can also have anti Pseudomonas aeruginosa biofilm and can improve the efficacy of tobramycin. Methods: to prove this conjecture, this study mainly observed the clinical isolates of linolenic acid and tobramycin on Pseudomonas aeruginosa, environmental isolates and The influence of laboratory standard strain (ATCC 27853). The formation of biofilm is evaluated by the difference of the thickness of biomembrane biomass using the crystal violet staining. The thicker the biofilm is, the more the dye is absorbed. Compared with the control group, the lighter the staining is, it is caused by the inhibition of the drug. Because the staining method can not distinguish the life attached to the biofilm. Cells and dead cells, we use Alarma Blue method to determine biofilm metabolic activity, to better explain the role of linolenic acid or tobramycin. In addition, we use fluorescence microscopy to observe the changes in biofilm biomass. Because of the formation of biofilm by a quorum induction system, we detected a sense of selective population by real-time quantitative PCR. The expression level of genes related to biofilm and virulence. On the other hand, a variety of virulence factors produced by Pseudomonas aeruginosa can cause tissue damage. Therefore, we also detected the expression of QS related virulence factors such as cluster motion, Pseudomonas aeruginosa, Las A activity, and azo protein egg white enzyme, thus confirming linolenic acid or combination. Whether brycomycin can reduce the production of these toxic phenotypes and reduce the toxicity of Pseudomonas aeruginosa. Results: the results showed that the minimal inhibitory concentration of linolenic acid and tobramycin on these strains was 1.56mg/ml and 0.3125mg/ml respectively, and one of the clinical isolates C2 was the minimal inhibitory concentration of Pseudomonas aeruginosa. In order to show resistance to tobramycin 0.078mg/ml, this strain was used to study the effect of linolenic acid on the minimal inhibitory concentration of linolenic acid on bacteria without the effect of tobramycin. The use of linolenic acid alone and the combination of tobramycin could destroy the formation of Pseudomonas aeruginosa biofilm and reduce the metabolic activity of biofilm cells. In dynamic tests, the maximum drug dose could further prevent the cluster movement compared with the untreated control group. Linolenic acid could also reduce the production of Pseudomonas aeruginosa and reduce the activity of azo casein, with dose-dependent, and not in tobramycin. The Las A activity was also inhibited. Gene expression analysis also found that It was confirmed that the combination of linolenic acid and tobramycin reduced the expression of the quorum induction system, the biofilm and the virulence related genes in Pseudomonas aeruginosa. The results of the drug interaction analysis also confirmed this synergistic effect. Conclusion: therefore, linolenic acid can inhibit the formation of Pseudomonas aeruginosa biofilm and can be a potential one. The combined therapy can reduce the dose of tobramycin and reduce the negative effects of aminoglycoside antibiotics on the human body, which lays a solid foundation for the future treatment and control of Pseudomonas aeruginosa infection.
【學(xué)位授予單位】：大連醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R446.5

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本文編號：2013529