本文選題：比色法 + 卟啉鐵/G-四鏈體DNA酶　； 參考：《重慶醫(yī)科大學(xué)》2017年碩士論文

【摘要】：生物傳感技術(shù)是由多學(xué)科相互交叉滲透形成的高新技術(shù)。利用該技術(shù)構(gòu)建的生物傳感器作為一種新型的檢測裝置,可以通過識別元件和換能器將被測物質(zhì)濃度轉(zhuǎn)化為可檢測的光、電等信號。比色傳感器因其光信號檢測簡便快捷,在分析檢測領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。近年來,納米材料在生物傳感器中的應(yīng)用研究已經(jīng)成為熱點(diǎn)。尤其是金納米顆粒(gold nanoparticles,Au NPs),因其獨(dú)特的光學(xué)特性使比色傳感器的靈敏度得到大大的提高。金黃色葡萄球菌腸毒素B(staphylococcal enterotoxin B,SEB)作為超抗原和過敏原在變態(tài)反應(yīng)性疾病中起著非常重要的作用,是引起敗血癥和膿毒癥最重要的毒素因子。因此,SEB的檢測具有重要的臨床意義。本課題是以SEB為檢測目標(biāo),構(gòu)建了一種基于金納米顆粒生成的比色新方法。該方法能夠快速簡便、低成本、高靈敏地檢測SEB,為相關(guān)疾病的臨床診斷提供了新工具。該方法能夠結(jié)合臨床檢測需求使用不同的識別元件,構(gòu)建通用型的檢測方法,為生物傳感技術(shù)提供了新思路。目的:基于卟啉鐵/G-四鏈體結(jié)構(gòu)的DNAzyme介導(dǎo)金納米顆粒生成導(dǎo)致的顏色改變,聯(lián)合適配體作為識別探針構(gòu)建通用型的比色法檢測平臺,并以SEB作為待檢物的代表,對新構(gòu)建的比色檢測平臺進(jìn)行評價和性能確認(rèn)。方法:1.金納米顆粒的生成:在2-(N-嗎啉基)乙磺酸(2-(N-morpholino)ethanesulphonic acid,MES)緩沖液中,利用不同濃度的過氧化氫將氯金酸還原成不同分散狀態(tài)的金納米顆粒,并對其進(jìn)行表征。2.具有辣根過氧化物酶活性的DNAzyme的形成:探針G和SEB適配體在反應(yīng)液中發(fā)生雜交反應(yīng),加入SEB和卟啉鐵,適配體可特異性與SEB結(jié)合,探針G與卟啉鐵形成具有辣根過氧化物酶活性的DNAzyme。3.比色傳感器的構(gòu)建:利用目標(biāo)物介導(dǎo)DNAzyme生成,進(jìn)一步控制金納米顆粒的合成速度,定量檢測樣本中的SEB。4.檢測條件的優(yōu)化:對MES緩沖液濃度、氯金酸濃度,過氧化氫濃度,檢測時間及適配體和探針G的核酸序列進(jìn)行優(yōu)化,以提高信噪比。5.新構(gòu)建比色法的性能評價:對傳感器的最低檢測限、線性范圍、特異性進(jìn)行評價。6.實(shí)際標(biāo)本的檢測:將已經(jīng)構(gòu)建好的比色生物傳感器用于血清樣本的檢測。結(jié)果:1.用紫外可見分光光度計(jì)、動態(tài)光散射、透射電鏡對生成的金納米粒子分別進(jìn)行光譜學(xué)和形態(tài)學(xué)的表征分析。藍(lán)色和紅色金納米顆粒溶液的紫外可見吸收光譜最大吸收峰分別在604 nm和557 nm處。動態(tài)光散射檢測得到兩種狀態(tài)的金納米顆粒的水動力平均直徑為282.4 nm和61.9 nm,分布系數(shù)為0.347和0.094。透射電鏡可見呈均一分散狀態(tài)和多不規(guī)則聚集狀態(tài)的兩種金納米顆粒。2.用瓊脂糖凝膠電泳對探針G和適配體的雜交反應(yīng)進(jìn)行表征,結(jié)果表明隨著SEB濃度的增加,雜交雙鏈逐漸解離。紫外可見分光光度計(jì)對DNAzyme的生成進(jìn)行驗(yàn)證,隨著SEB的增加,DNAzyme的生成也增加。3.當(dāng)目標(biāo)物加入到構(gòu)建的比色傳感器,DNAzyme生成,降低了金納米顆粒的生成速率,納米顆粒溶液呈現(xiàn)藍(lán)色,從而實(shí)現(xiàn)目標(biāo)物的檢測。4.優(yōu)化實(shí)驗(yàn)得到的最佳條件為:MES緩沖液的濃度為2 m M,氯金酸的濃度為0.3 m M,過氧化氫的濃度120μM,檢測時間反應(yīng)后15 min,適配體選用APTSEB1,探針G選用G3。5.在最優(yōu)條件下對新構(gòu)建的比色傳感器進(jìn)行評價:SEB濃度在0.1pg m L-1-1000 pg m L-1范圍內(nèi)與550 nm處降低的吸光度值呈線性相關(guān),R2=0.9895;SEB肉眼可識別的最低檢測限為1 pg m L-1;該傳感器能特異識別SEB,在高濃度BSA、凝血酶、Ig G存在的情況下,均只產(chǎn)生微弱的背景信號。6.在血清中加入SEB,配制三組不同濃度的SEB(10 pg m L-1,100pg m L-1,1000 pg m L-1),該法測得的結(jié)果與緩沖液配制相同濃度的SEB檢測結(jié)果無明顯差異,表明該傳感器可以正確檢測血清等復(fù)雜基質(zhì)的臨床樣本。結(jié)論:本研究成功構(gòu)建了基于卟啉鐵/G-四鏈體結(jié)構(gòu)的DNAzyme介導(dǎo)金納米顆粒生成的比色法檢測平臺,該傳感器無酶無修飾,操作簡單。用于檢測SEB時靈敏度高,檢測線性范圍寬,特異性好,并可用于臨床血清樣本中SEB的檢測。
[Abstract]:Biosensor is a high and new technology which is formed by interpenetration of multidisciplinary. The biosensor constructed by this technology is used as a new type of detection device, and the measured material concentration can be transformed into detectable light, electricity and other signals by identifying elements and transducers. In recent years, the application of nanomaterials in biosensors has become a hot spot. In particular, gold nanoparticles (gold nanoparticles, Au NPs) have greatly improved the sensitivity of colorimetric sensor because of its unique optical properties. Staphylococcus aureus enterotoxin B (staphylococcal enterotoxin B, SEB) As a superantigen and anaphylaxis, it plays a very important role in allergic diseases and is the most important toxin factor in sepsis and sepsis. Therefore, the detection of SEB has important clinical significance. This subject is a new method based on the formation of gold nanoparticles by using SEB as the detection target. This method can be fast. The rapid, simple, low cost, and highly sensitive detection of SEB provides a new tool for the clinical diagnosis of related diseases. This method can use different identification components in combination with clinical detection requirements and construct a general detection method, which provides a new idea for biological sensing technology. Objective: DNAzyme mediated gold nanoparticles based on the structure of porphyrin iron /G- four chain body Color change caused by grain generation, combined aptamers as identification probes to construct a generic colorimetric detection platform, and use SEB as a representative to evaluate and confirm the performance of the newly constructed colorimetric detection platform. Method: the generation of 1. gold nanoparticles: 2- (N-morpholino) ethanesulphonic acid, M at 2- (N- Ma Lanji) ethanesulphonic acid ES) in the buffer, chlorosauric acid was reduced to gold nanoparticles with different dispersing state by hydrogen peroxide with different concentrations, and the formation of DNAzyme was characterized by.2. with horseradish peroxidase activity: hybridization reaction between probe G and SEB aptamers in the reaction liquid, added into SEB and porphyrin iron, the aptamers are specifically associated with SEB The formation of the DNAzyme.3. colorimetric sensor with horseradish peroxidase activity by needle G and porphyrin: using target to mediate DNAzyme formation, further controlling the synthesis speed of gold nanoparticles, and optimizing the SEB.4. detection conditions in the samples: the concentration of MES buffer, the concentration of chloro gold acid, the concentration of hydrogen peroxide, the detection time and the detection time. The nucleic acid sequence of the aptamer and the probe G is optimized to improve the performance evaluation of the signal to noise ratio.5. new construction colorimetric method: the minimum detection limit of the sensor, the linear range, the specificity of the detection of the actual specimens of.6.: a good colorimetric biosensor is used to detect the blood samples. Results: 1. with UV visible spectrophotometry The maximum absorption peaks of the UV visible absorption spectra of blue and red gold nanoparticles were 604 nm and 557 nm respectively. The average hydrodynamic diameter of the gold nanoparticles with two forms was 2, respectively. The average hydrodynamic diameter of the gold nanoparticles with two forms was 2. 82.4 nm and 61.9 nm, the distribution coefficients of 0.347 and 0.094. transmission electron microscopy showed that two gold nanoparticles with homogeneous and irregular aggregation state.2. were characterized by agarose gel electrophoresis on the hybridization reaction of the probe G and the aptamers. The results showed that the hybrid double chains gradually dissociated with the increase of SEB concentration. Ultraviolet visible light was visible. The degree meter validates the generation of DNAzyme. With the increase of SEB, the generation of DNAzyme also increases.3. when the target is added to the constructed colorimetric sensor, DNAzyme is generated, and the formation rate of gold nanoparticles is reduced, and the nano particle solution is blue. Thus the optimum condition for the test of the target detection.4. optimization experiment is the MES buffer solution. The concentration is 2 m M, the concentration of chloro gold acid is 0.3 m M, the concentration of hydrogen peroxide is 120 mu M, the detection time is 15 min, the aptamer is chosen APTSEB1, and the probe G selects G3.5. under the optimal condition to evaluate the newly constructed colorimetric sensor. The SEB concentration is linearly related to the absorbance value which is reduced in 550 places within the 0.1pg m. R2=0.9895; the minimum detection limit for SEB's naked eye is 1 pg m L-1; the sensor can identify SEB specifically. In the presence of high concentration of BSA, thrombin and Ig G, only a weak background signal.6. is added to the serum for SEB, and the results and buffers of the three groups of SEB (10) are prepared. There is no obvious difference between the SEB detection results of the same concentration of liquid, indicating that the sensor can detect the clinical samples of complex matrix of serum and so on. Conclusion: This study successfully constructed a colorimetric detection platform based on the structure of the porphyria iron /G- four chain body structure of DNAzyme mediated gold nanoparticles. The sensor has no enzyme without modification, and the operation is simple. It has high sensitivity, wide linearity and specificity in detecting SEB, and can be used for the detection of SEB in clinical serum samples.
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R446.5;TP212.3

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本文編號：1912814