本文選題：新德里金屬β-內(nèi)酰胺酶 + 耐藥監(jiān)測��； 參考：《中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院》2017年博士論文

【摘要】：產(chǎn)新德里金屬β-內(nèi)酰胺酶(NDM)耐藥菌自2010年被傳染病領(lǐng)域國際頂級雜志《柳葉刀》報道以來,以驚人的傳播速度和超強的耐藥性引起人們的廣泛關(guān)注。目前,在全球范圍內(nèi)已有超過20個國家出現(xiàn)產(chǎn)NDM耐藥菌病例,除南美洲西部、非洲中部個別國家未報道外,其他國家和地區(qū)均有報道。攜帶blaNDM基因耐藥菌對包括碳青霉烯類的常用抗菌藥物均耐藥,尚缺乏明確的治療方案。研究發(fā)現(xiàn),NDM-1有NDM-2到NDM-16共15個突變體,多由不動桿菌屬細菌、大腸埃希氏菌和肺炎克雷伯氏菌攜帶。越來越多的數(shù)據(jù)表明產(chǎn)NDM耐藥菌已在全球范圍流行并引發(fā)多種類型感染,是威脅人類健康的主要公共衛(wèi)生問題之一。因此,有效控制和治療產(chǎn)NDM耐藥菌感染具有重要現(xiàn)實意義。細菌耐藥監(jiān)測是防控產(chǎn)NDM耐藥菌的重要組成部分,及時準(zhǔn)確了解產(chǎn)NDM耐藥菌的流行現(xiàn)狀和特點,是預(yù)防和控制產(chǎn)NDM耐藥菌感染的關(guān)鍵所在。既往研究發(fā)現(xiàn),我國主要以攜帶blaNDM-1基因的不動桿菌為主,而關(guān)于其他NDM型別和其他菌屬在我國的流行特點,研究報道甚少。為更全面了解產(chǎn)NDM耐藥菌在我國的流行現(xiàn)狀、流行規(guī)律及傳播機制,本課題對2010年至2015年期間來自全國11個省市、25家醫(yī)院的1559株非重復(fù)碳青霉烯類耐藥菌(含醫(yī)院污水來源156株)進行分析檢測,采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)法篩查blaNDM基因,運用流行病學(xué)及統(tǒng)計分析方法對不同來源、不同菌屬、不同型別產(chǎn)NDM耐藥菌引起感染性疾病的三間分布進行分析;利用基于全基因組平均核苷酸一致性(ANI)分析法及16sRNA序列分析對產(chǎn)NDM耐藥菌進行菌種鑒定,利用核心基因組多位點序列分型(cgMLST)方法,對不同菌屬產(chǎn)NDM耐藥菌進行聚類分型;VITEK2全自動微生物藥敏分析儀對攜帶blaNDM基因菌株進行耐藥性分析;同時,利用Southern blot雜交法、濾膜接合法和細菌全基因組測序分別對其進行blaNDM基因定位及轉(zhuǎn)移特性、blaNDM基因周邊結(jié)構(gòu)分析,以期明確中國部分地區(qū)產(chǎn)NDM耐藥菌的分子特征,從分子水平解釋產(chǎn)NDM耐藥菌blaNDM基因可能的傳播和流行規(guī)律。本研究的主要結(jié)果和結(jié)論如下:1.不同型別、不同菌屬產(chǎn)NDM耐藥菌已在中國部分地區(qū)流行播散。1559株實驗菌中篩查出77株攜帶blaNDM基因菌株,陽性率為4.9%。1)時間分布特點:患者來源耐藥菌的blaNDM基因陽性率逐年升高。2)空間分布特點:我國東北、華北、華東、中南四大地區(qū),11個城市均有產(chǎn)NDM耐藥菌,其中北京、上海、�？�、廈門等一線和沿海城市陽性菌株數(shù)量較多、陽性率較高,且產(chǎn)NDM耐藥菌在醫(yī)院污水中廣泛存在。3)人群分布及標(biāo)本來源分布特點:產(chǎn)NDM耐藥菌患者來源中,男性顯著多于女性,年齡低于10歲的兒童及大于60歲的老人顯著多于其他年齡段患者,推測男性兒童和老年人是感染產(chǎn)NDM耐藥菌的易感人群;呼吸內(nèi)科是blaNDM基因陽性菌檢出最多的科室,痰液標(biāo)本顯著多于糞便、血液和尿液等其他標(biāo)本,推測相比其他傳播方式,產(chǎn)NDM耐藥菌更易通過呼吸道感染和擴散。4)基因型別特點:本研究發(fā)現(xiàn)blaNDM的四種基因型,包括blaNDM-1、blaNDM-3、blaNDM-5和bla NDM-13。產(chǎn)NDM-1耐藥菌最多,產(chǎn)NDM-5耐藥菌次之,NDM-5為第二優(yōu)勢型別,且在北京、沈陽、�？�、濟南、上海等多個城市均有發(fā)現(xiàn),提示攜帶blaNDM-5基因菌株也已在中國廣泛傳播流行。5)菌屬類別特點:產(chǎn)NDM耐藥菌中,不動桿菌屬細菌數(shù)量最多,其次是肺炎克雷伯氏菌和大腸埃希氏菌,近年來產(chǎn)NDM肺炎克雷伯氏菌和產(chǎn)NDM大腸埃希氏菌已在中國部分地區(qū)流行。首次發(fā)現(xiàn)1株產(chǎn)NDM-3耐藥大腸埃希氏菌和1株攜帶blaNDM-13基因腸炎沙門氏菌,且產(chǎn)NDM-1、NDM-3、NDM-5、NDM-13耐藥菌已蔓延至腸道病原菌。2.利用ANI分析可成功鑒定不動桿菌屬菌種。首次利用ANI分析方法對產(chǎn)NDM耐藥不動桿菌屬細菌進行菌種鑒定,38株產(chǎn)NDM耐藥不動桿菌屬細菌中,有5株托尼爾氏不動桿菌被16S rRNA誤鑒定為其他菌種,其中3株被鑒定為鮑氏不動桿菌,1株瓊氏不動桿菌和1株約氏不動桿菌。3.cgMLST對產(chǎn)NDM耐藥菌屬內(nèi)菌株親緣關(guān)系研究具有重要意義。cgMLST聚類分析發(fā)現(xiàn),產(chǎn)NDM肺炎克雷伯氏菌和大腸埃希氏菌可能已在不同地區(qū)的人群中傳播,且產(chǎn)NDM托尼爾氏不動桿菌和產(chǎn)NDM乙酸鈣不動桿菌可能已在不同地區(qū)、不同來源中播散。本研究建立產(chǎn)NDM耐藥菌親緣關(guān)系研究的cgMLST實驗方法,為產(chǎn)NDM耐藥菌監(jiān)測技術(shù)平臺和分子分型數(shù)據(jù)庫建立打下了堅實基礎(chǔ)。4.中國部分地區(qū)產(chǎn)NDM耐藥菌耐藥譜廣,且不同型別、不同菌屬耐藥譜存在差異。1)產(chǎn)NDM耐藥菌都是多重耐藥菌,多為泛耐藥菌,耐藥譜廣:77株產(chǎn)NDM耐藥菌均對3類以上抗生素耐藥,為多重耐藥菌。所有菌株對氨芐西林、頭孢唑林和頭孢曲松的耐藥率都高達100%,對頭孢他啶和頭孢吡肟兩種抗菌藥物的耐藥率都達到了98.7%,對哌拉西林亦是高水平耐藥,耐藥率為93.5%,對氨曲南的耐藥率高達97.4%;所有菌株對碳青霉烯類的亞胺培南和美羅培南、硝基呋喃類的呋喃妥英、磺胺類的復(fù)方新諾明均表現(xiàn)高水平耐藥,只對氨基糖苷類的阿米卡星較為敏感,但耐藥率仍為24.7%。2)產(chǎn)NDM-5菌株耐藥性高于產(chǎn)NDM-1耐藥菌:對不同型別產(chǎn)NDM耐藥菌的耐藥性進行比較,發(fā)現(xiàn)產(chǎn)NDM-5菌株的耐藥率顯著高于產(chǎn)NDM-1菌株的耐藥率。3)不同菌屬產(chǎn)NDM耐藥菌耐藥譜不同:對不同菌屬產(chǎn)NDM耐藥菌的耐藥性進行比較,發(fā)現(xiàn)不同菌屬產(chǎn)NDM耐藥菌耐藥譜不同,不動桿菌屬細菌對哌拉西林的耐藥率顯著低于其他菌屬,沙門氏菌屬細菌對阿米卡星、環(huán)丙沙星和左氧氟沙星均敏感,檸檬酸桿菌屬細菌僅對四環(huán)素敏感;埃希氏菌屬細菌僅對阿米卡星表現(xiàn)低水平耐藥。提示,產(chǎn)NDM耐藥菌感染治療與防控過程中,抗菌藥物的適當(dāng)調(diào)整與合理應(yīng)用尤為重要。5.相比不動桿菌,攜帶blaNDM基因的質(zhì)粒易在腸桿菌科細菌中傳播,且耐藥性更強。1)blaNDM基因多通過質(zhì)粒在細菌屬內(nèi)及屬間傳播:77株產(chǎn)NDM耐藥菌株的blaNDM-1基因進行定位分析發(fā)現(xiàn),所有菌株都含有2-5個質(zhì)粒,67株blaNDM基因定位于質(zhì)粒上,10株blaNDM基因在染色體上。定位于30~50kb大小質(zhì)粒菌株最多,涵蓋多個菌種,可能有優(yōu)勢質(zhì)粒在腸桿菌科細菌及不動桿菌屬細菌間傳播。11株菌2個質(zhì)粒同時含有blaNDM基因,耐藥譜相比其他產(chǎn)NDM耐藥菌較廣,推測多個含耐藥基因質(zhì)�？赡茉鰪娏司甑哪退幮�。耐藥基因在染色體上的產(chǎn)NDM耐藥菌多為不動桿菌屬細菌。2)腸桿菌科細菌比不動桿菌的blaNDM基因更易發(fā)生水平轉(zhuǎn)移:67株blaNDM基因定位于質(zhì)粒的產(chǎn)NDM耐藥菌進行接合轉(zhuǎn)移實驗,49株成功將含blaNDM基因質(zhì)粒轉(zhuǎn)移至受體菌J53中,未發(fā)生接合轉(zhuǎn)移菌株中,18株均為不動桿菌屬細菌。3)腸桿菌科細菌blaNDM陽性接合子耐藥性強于不動桿菌:對含blaNDM-1基因陽性接合菌耐藥情況進行評估發(fā)現(xiàn),所有腸桿菌科菌株具備原始供體菌典型的耐藥性,均對青霉素類、頭孢菌素類和碳青霉烯類抗生素表現(xiàn)出耐藥,而多數(shù)不動菌屬細菌含blaNDM-1基因接合子雖獲得了質(zhì)粒,但卻沒有獲得相應(yīng)對碳青霉烯類抗菌藥物的耐藥表型,僅對頭孢菌素類表現(xiàn)為耐藥,不具備原始供體菌典型的耐藥性。6.似Tn125轉(zhuǎn)座結(jié)構(gòu)在blaNDM基因傳播過程中起著重要作用,中國存在產(chǎn)NDM耐藥菌引發(fā)嚴(yán)重公共衛(wèi)生問題風(fēng)險。1)blaNDM基因通過似Tn125轉(zhuǎn)座結(jié)構(gòu),在細菌屬內(nèi)及屬間傳播:選取17株不同菌屬、blaNDM-1基因不同位置(質(zhì)粒及染色體)代表菌株,利用菌株二代全基因組測序方法,對其blaNDM-1基因周邊結(jié)構(gòu)進行分析發(fā)現(xiàn),17株產(chǎn)NDM耐藥菌分7種不同型別似Tn125轉(zhuǎn)座結(jié)構(gòu),均與pNDM-BJ01的完整Tn125結(jié)構(gòu)不同。2)ISAba125轉(zhuǎn)座酶不是blaNDM基因傳播的必需酶:首次發(fā)現(xiàn)2株Tn125上下游ISAba125轉(zhuǎn)座酶同時發(fā)生丟失的菌株,分別為魯氏不動桿菌和托尼爾氏不動桿菌;之前報道在blaNDM-1基因傳播過程中發(fā)揮重要作用的ISAba125轉(zhuǎn)座酶發(fā)生丟失,由此推斷,ISAba125轉(zhuǎn)座酶不是blaNDM基因傳播的必需酶。3)中國攜帶blaNDM基因菌株源于不動桿菌:結(jié)合上述研究和國內(nèi)外相關(guān)報道,及blaNDM-1基因定位于染色體多為不動桿菌屬細菌這一現(xiàn)象,推測blaNDM-1基因在中國最早來源于不動桿菌,blaNDM-1基因多嵌合于不動桿菌屬細菌染色體上,Tn125或似Tn125轉(zhuǎn)座結(jié)構(gòu)在介導(dǎo)blaNDM-1在不動桿菌屬細菌屬內(nèi)傳播的同時,轉(zhuǎn)移至克雷伯氏菌、埃希氏菌、沙門氏菌等腸桿菌科細菌中。4)中國存在產(chǎn)NDM耐藥菌引發(fā)嚴(yán)重公共衛(wèi)生問題風(fēng)險:結(jié)合接合轉(zhuǎn)移及陽性接合子耐藥實驗發(fā)現(xiàn),不動桿菌的blaNDM-1基因相比腸桿菌科細菌,不易通過基因水平轉(zhuǎn)移至其他菌株,這可能也是中國到目前為止,未發(fā)生產(chǎn)NDM耐藥菌引發(fā)嚴(yán)重公共衛(wèi)生問題的原因。但腸桿菌科細菌的blaNDM-1基因基本都位于質(zhì)粒上,且接合轉(zhuǎn)移后對碳青霉烯類高水平耐藥。隨著產(chǎn)NDM腸桿菌科細菌逐年增多,中國有產(chǎn)NDM耐藥菌引發(fā)嚴(yán)重公共衛(wèi)生問題的風(fēng)險,而blaNDM基因傳播過程所需關(guān)鍵調(diào)控因子有待深入研究。綜上所述,本研究通過細菌耐藥監(jiān)測研究,獲得產(chǎn)NDM耐藥菌感染發(fā)生率和耐藥現(xiàn)狀,發(fā)現(xiàn)不同型別、不同菌屬產(chǎn)NDM耐藥菌在中國部分地區(qū)流行播散;我國產(chǎn)NDM耐藥菌耐藥譜廣,且不同型別、不同菌屬耐藥譜存在差異,這些結(jié)果為臨床治療產(chǎn)NDM耐藥菌引起的重癥感染,制訂科學(xué)、有效的預(yù)防和控制措施提供了重要的實驗依據(jù)。進一步對中國部分地區(qū)產(chǎn)NDM耐藥細菌進行遺傳多態(tài)性、基因定位及轉(zhuǎn)移特性、blaNDM基因周邊結(jié)構(gòu)等研究,初步闡明了blaNDM-1基因在中國最早來源于不動桿菌,在屬內(nèi)傳播的同時,轉(zhuǎn)移至克雷伯氏菌、埃希氏菌、沙門氏菌等腸桿菌科細菌中。而產(chǎn)NDM耐藥腸桿菌科細菌比產(chǎn)NDM耐藥不動桿菌的blaNDM基因更易發(fā)生基因水平轉(zhuǎn)移,且轉(zhuǎn)移后具備供體菌典型的碳青霉烯類抗菌藥物耐藥性。隨著被報道產(chǎn)NDM腸桿菌科細菌數(shù)目逐年增加,推測中國存在產(chǎn)NDM耐藥菌引發(fā)嚴(yán)重公共衛(wèi)生問題的風(fēng)險。因此,提高對產(chǎn)NDM耐藥菌的檢測、監(jiān)測和感染控制意識,加強對中國產(chǎn)NDM耐藥菌的流行病學(xué)監(jiān)測,警惕其流行變遷、毒力和耐藥的變化,對于科學(xué)防控產(chǎn)NDM耐藥菌感染性疾病在中國甚至全世界的廣泛傳播有重要意義。
[Abstract]:In order to understand the prevalent status and characteristics of NDM - resistant bacteria in China , it was found that NDM - 1 had NDM - 2 to NDM - 16 . More and more data showed that NDM - 1 had NDM - 2 to NDM - 16 , which was one of the major public health problems threatening human health . NDM - 3 - resistant Escherichia coli ( NDM - 3 ) , NDM - 5 and NDM - 13 ( NDM - 5 ) were found to be more susceptible to infection of NDM . The drug resistance of NDM - 5 strains was higher than that of NDM - 1 strains . In this study , we found that the resistance of the gene to the NDM - 1 gene was not the essential enzyme for the transmission of NDM - 1 gene . In conclusion , the research on the drug resistance of NDM - resistant bacteria in China is more likely to cause serious public health problems . In conclusion , the research on the genetic polymorphism , gene location and transfer characteristics of NDM - resistant bacteria in China and the peripheral structure of blaNDM gene have provided important experimental basis for the clinical treatment of NDM - resistant bacteria .
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R446.5

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本文編號：1903880