本文選題：心血管疾病　切入點：脂蛋白代謝　出處：《東北師范大學》2017年碩士論文

【摘要】：載脂蛋白C3(apolipoprotein,APOC3)是在肝內脂蛋白代謝過程中起到重要調節(jié)作用的一類含量豐富的脂蛋白轉運蛋白。若體內APOC3含量增高,將對脂質代謝造成直接影響,從而引起高甘油三酯血癥、冠心病、動脈粥樣硬化、代謝綜合征等多種疾病的發(fā)生。研究表明,APOC3相比于TG是更有效的冠心病預測因子,而且,APOC3可以作為心血管疾病(cardiovascular disease,CVD)風險的獨立預測因子,以APOC3為靶點治療CVD的研究也已進入臨床試驗階段。因此,實時監(jiān)測APOC3水平并把APOC3作為CVD臨床危險因素的新生物標志物,將對心血管疾病的預防與治療具有重要意義。目前血脂檢測的方法比較復雜,APOC3作為新的CVD風險預測因子,急需建立一種快速、準確、簡單的檢測APOC3的方法。雙抗體夾心ELISA具有敏感度高、特異性強、操作簡便等特點,且可以進行高通量檢測。為了建立APOC3的雙抗體夾心ELISA方法,我們首先利用雜交瘤技術制備了APOC3的單克隆抗體,之后建立了APOC3的雙抗體夾心ELISA檢測方法,具體如下。一、APOC3抗原的制備單克隆抗體是決定雙抗體夾心ELISA檢測方法特異性和靈敏度的關鍵,為了制備親和力高、特異性強的單克隆抗體,我們首先利用前期構建的APOC3原核表達系統,在優(yōu)化條件下誘導表達出GST-APOC3融合蛋白,并用Western blot進行了鑒定,在分析了GST-APOC3融合蛋白的可溶性后,大量表達了GST-APOC3蛋白,并用GSTrap FF親和層析柱進行了分離與純化,之后利用Bradford法對純化的融合蛋白進行定量。二、利用雜交瘤技術制備APOC3單克隆抗體利用純化后的GST-APOC3蛋白免疫BALB/C小鼠,三次免疫后取小鼠血清檢測抗體效價,之后對效價最高的小鼠進行加強免疫,免疫后第3天進行了細胞融合。同時對間接ELISA檢測體系進行了優(yōu)化,然后通過間接ELISA檢測方法篩選陽性雜交瘤細胞并克隆化,最終獲得了6株可分泌APOC3單克隆抗體的雜交瘤細胞,分別命名為1B7、2G8、3G10、3E9、3B7和3D9。三、APOC3單克隆抗體的大量制備、純化及鑒定利用雜交瘤細胞通過體內誘生法制備了小鼠腹水,并對腹水中APOC3單克隆抗體的效價進行了檢測。結果顯示,6株抗體效價均大于1:1.28×105,其中3B7和3D9抗體的效價可達1:3.125×107以上。之后利用硫酸銨沉淀法對腹水中的抗體進行了純化,獲得了抗APOC3單克隆抗體,利用間接ELISA方法對單克隆抗體的類型進行分析。結果顯示,1B7重鏈為IgG2a,2G8和3B7重鏈為IgM,3E9、3G10和3D9的重鏈為IgG1,6株抗體的輕鏈均為Kappa型。最后,我們又通過間接ELISA和Western blot方法對抗APOC3單克隆抗體的特異性進行了鑒定,證實所制備的單克隆抗體確實能夠與APOC3融合蛋白發(fā)生特異性反應。四、APOC3雙抗體夾心ELISA檢測方法的建立利用所制備的單克隆抗體和多克隆抗體建立了APOC3雙抗體夾心ELISA檢測方法,并對檢測體系進行了條件優(yōu)化,用構建的體系對不同樣品進行了檢測并與商品化試劑盒檢測結果進行了比較,結果表明本研究構建的雙抗夾心ELISA檢測體系能特異地檢測到原核表達的APOC3蛋白,而不能檢測到天然的APOC3蛋白。本研究為建立檢測APOC3含量的方法提供了有益的借鑒,為以APOC3為目標的CVD血脂分析體系的完善奠定了物質基礎。
[Abstract]:In order to establish an apoC3 antibody sandwich ELISA method , we first used hybridoma technique to prepare the monoclonal antibody of APOC3 . Three monoclonal antibodies against APOC3 were identified by indirect ELISA and Western blot .

【學位授予單位】：東北師范大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R446.6

【參考文獻】

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本文編號：1681170