發(fā)布時間：2018-03-09 09:27

  本文選題：內(nèi)毒素耐受　切入點(diǎn)：巨噬細(xì)胞RAW264.7　出處：《西南醫(yī)科大學(xué)》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：目的:構(gòu)建小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7內(nèi)毒素耐受和膿毒癥模型,使用iTRAQ技術(shù)分析內(nèi)毒素耐受狀態(tài)下與膿毒癥狀態(tài)下差異性蛋白的表達(dá),探討早期內(nèi)毒素耐受機(jī)制。方法:1、用含10%胎牛血清的高糖型DMEM培養(yǎng)基(完全培養(yǎng)基)體外培養(yǎng)小鼠巨噬細(xì)胞RAW246.7,獲取活力良好的細(xì)胞后,取對數(shù)期細(xì)胞,計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù),調(diào)濃度為5×105/ml,接種于6cm培養(yǎng)皿,使用隨機(jī)數(shù)字法分成2組,分別為內(nèi)毒素耐受組(耐受組)和膿毒癥組,兩組種板后均用完全培養(yǎng)基培養(yǎng)24h。2、24h后更換培養(yǎng)液,耐受組用含10ng/ml LPS的完全培養(yǎng)基3ml,預(yù)處理細(xì)胞24h,膿毒癥組用完全培養(yǎng)基3ml培養(yǎng)24h,24h后兩組再次更換培養(yǎng)液,用含100ng/ml LPS的完全培養(yǎng)基刺激細(xì)胞4h、24h;3、刺激4h后,(1)離心,取細(xì)胞沉淀,于-80℃冰箱保存,收集培養(yǎng)液上清,在實(shí)驗(yàn)過程中顯微鏡觀察各組細(xì)胞形態(tài)變化并拍照。(2)取培養(yǎng)液上清液行ELISA檢測TNF-α、IL-6、IL-10。(3)流式細(xì)胞術(shù)檢測巨噬細(xì)胞膜上CD16/32表達(dá)。(4)提取蛋白,進(jìn)行iTRAQ標(biāo)記,篩選出差異蛋白,然后使用生物信息學(xué)分析(GO注釋、KEGG信號通路,蛋白網(wǎng)絡(luò)互作圖、韋恩圖)。4、刺激24h后,用流式細(xì)胞術(shù)檢測巨噬細(xì)胞膜上CD16/32表達(dá)。5、細(xì)胞處理及樣本留取采用3次生物學(xué)重復(fù),收集和統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù),分析結(jié)果。結(jié)果:1、耐受組預(yù)處理后較膿毒癥組巨噬細(xì)胞活化明顯,伸出偽足,表面積變大,貼壁更緊密。2、ELISA檢測細(xì)胞因子濃度:耐受組刺激4h時細(xì)胞上清中TNF-α水平(18273.5±10154.4pg/ml)較膿毒癥組(133233.7±68955.9pg/ml)明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,p值0.05,且細(xì)胞上清中il-6水平(1549.8±399.2pg/ml)較膿毒癥組(3175.8±959.0pg/ml)明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,p值0.05;但il-10水平(351.1±184.2pg/ml)較膿毒癥組(220.3±121.4pg/ml)略有升高,無統(tǒng)計(jì)學(xué)差別,p值0.05。3、流式細(xì)胞術(shù)檢測巨噬細(xì)胞膜上cd16/32表達(dá):耐受組刺激4h后細(xì)胞表面cd16/32陽性率(75.33%)較膿毒癥組(49.69%)高,p0.05;刺激24h細(xì)胞表面cd16/32陽性率(79.07%)較膿毒癥組(94.27%)低,p0.05,但與陰性對照組(54.11%)相比,膿毒癥組和耐受組cd16/32均增高,p0.05。4、刺激4h后,用itraq技術(shù)分析,兩組共鑒定到4086個蛋白,而耐受組與膿毒癥組的總蛋白比較,有63個顯著差異表達(dá)蛋白,其中36個上調(diào)(比值1.2),27個蛋白下調(diào)(比值0.833)。對這些差異表達(dá)的蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)分析得到如下結(jié)果:(1)go注釋:差異蛋白的生物學(xué)過程主要參與器官組織生長發(fā)育、生物質(zhì)量調(diào)節(jié)、外界刺激反應(yīng);分子功能主要是氧化還原酶激活、受體連接、dna連接、抗氧化活性;細(xì)胞組分涉及染色質(zhì)、胞外區(qū)、膜小泡、細(xì)胞質(zhì)囊泡。(2)kegg信號通路分析63個差異蛋白共獲得112條信號通路,其中p0.05的信號通路有27條,主要有tlr信號通路、nf-κb信號通路和tnf信號通路以及ppar信號通路。(3)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖中見hmga1、hmga2、hmgb1、hmgb2蛋白存在相互關(guān)聯(lián)。(4)韋恩圖中完全重疊部分共有差異蛋白35個,其中21個蛋白上調(diào),14個蛋白下調(diào)。結(jié)論:1、初始10ng/mllps預(yù)處理24小時,隨后100ng/mllps刺激4小時能誘導(dǎo)出巨噬細(xì)胞早期內(nèi)毒素耐受模型。2、在內(nèi)毒素耐受早期狀態(tài)時促炎因子tnf-α、il-6表達(dá)降低,il-10水平略有升高。3、使用iTRAQ技術(shù)能鑒定出蛋白并進(jìn)行早期內(nèi)毒素耐受差異蛋白的篩選,生物信息學(xué)對這些可能與早期內(nèi)毒素耐受相關(guān)的蛋白進(jìn)行分析,有助于總結(jié)可能參與內(nèi)毒素耐受的蛋白的功能、所在的細(xì)胞成分及蛋白間相互聯(lián)系、可能相關(guān)的信號通路。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：西南醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R459.7

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 江澤波;黃閏月;張嫻;胡金萍;趙晉;曾星;;豬苓多糖對M1型巨噬細(xì)胞細(xì)胞因子表達(dá)的調(diào)節(jié)作用[J];細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志;2014年10期

2 李康;郭強(qiáng);王翠妮;陳敏;徐薇;熊思東;;M1和M2型巨噬細(xì)胞表型的比較分析[J];現(xiàn)代免疫學(xué);2008年03期

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本文編號：1587943