發(fā)布時間：2018-03-05 12:13

  本文選題：結(jié)核桿菌　切入點：過表達　出處：《石河子大學》2016年碩士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：目的:構(gòu)建Pup/Mpa/Dop/paf A基因過表達的結(jié)核分枝桿菌國際標準強毒株H37Rv菌株臨床分離株(以下簡稱H37Rv菌株)、Pup/Mpa/Dop/paf A基因過表達的結(jié)核分枝桿菌國際標準無毒株H37Ra菌株臨床分離株(以下簡稱H37Ra菌株)和Pup/Mpa/Dop/paf A基因過表達的新疆地區(qū)流行的優(yōu)勢強毒結(jié)核分枝桿菌臨床分離株(以下簡稱XJ菌株)。比較分析和探討研究Pup/Mpa/Dop/paf A基因過表達新疆地區(qū)流行的優(yōu)勢強毒結(jié)核分枝桿菌臨床分離株致病性的影響。方法:提取本課題組前期構(gòu)建的結(jié)核桿菌-大腸桿菌重組穿梭質(zhì)粒PMV361Pup,PMV361Mpa,PMV361Dop和PMV361paf A,進一步利用電轉(zhuǎn)化方法分別將重組穿梭質(zhì)粒PMV361Pup,PMV361Mpa,PMV361Dop和PMV361paf A轉(zhuǎn)入H37Rv菌株臨床分離株、H37Ra菌株臨床分離株和新疆優(yōu)勢強毒菌株臨床分離株的感受態(tài)細胞,分別構(gòu)建Pup基因過表達的H37Rv菌株臨床分離株(以下簡稱H37Rv::Pup菌株),Mpa基因過表達的H37Rv菌株臨床分離株(以下簡稱H37Rv::Mpa菌株),Dop基因過表達的H37Rv菌株臨床分離株(以下簡稱H37Rv::Dop菌株),paf A基因過表達的H37Rv菌株臨床分離株(以下簡稱H37Rv::paf A菌株),Pup基因過表達的H37Ra菌株臨床分離株(以下簡稱H37Ra::Pup菌株),Mpa基因過表達的H37Ra菌株臨床分離株(以下簡稱H37Ra::Mpa菌株),Dop基因過表達的H37Ra菌株臨床分離株(以下簡稱H37Ra::Dop菌株),paf A基因過表達的H37Ra菌株臨床分離株(以下簡稱H37Ra::paf A菌株),Pup基因過表達的新疆優(yōu)勢強毒菌株臨床分離株(以下簡稱XJ::Pup菌株),Mpa基因過表達的新疆優(yōu)勢強毒菌株臨床分離株(以下簡稱XJ::Mpa菌株),Dop基因過表達的新疆優(yōu)勢強毒菌株臨床分離株(以下簡稱XJ::Dop菌株),paf A基因過表達的新疆優(yōu)勢強毒菌株臨床分離株(以下簡稱XJ::paf A菌株),應用QRT-PCR技術(shù)檢測及鑒定已構(gòu)建的各Pup/Mpa/Dop/paf A基因過表達的H37Rv菌株組、Pup/Mpa/Dop/paf A基因過表達的H37Ra菌株組和Pup/Mpa/Dop/paf A基因過表達的新疆優(yōu)勢強毒菌株組的各Pup/Mpa/Dop/paf A基因的m RNA表達水平;分別用構(gòu)建的Pup/Mpa/Dop/paf A基因過表達的H37Ra菌株、H37Rv菌株和新疆地區(qū)流行的優(yōu)勢強毒結(jié)核分枝桿菌菌株組感染小鼠腹腔巨噬細胞,同時設(shè)定H37Ra菌株、H37Rv菌株和新疆地區(qū)流行的優(yōu)勢強毒結(jié)核分枝桿菌菌株組感染小鼠腹腔巨噬細胞作為對照組,于感染模型復制成功后1h、6 h、12 h及24 h,利用流式細胞技術(shù)檢測各組感染巨噬細胞的凋亡率,并分析其時相性變化。分別用各Pup/Mpa/Dop/paf A基因過表達H37Rv菌株組,Pup/Mpa/Dop/paf A基因過表達H37Ra菌株組和Pup/Mpa/Dop/paf A基因過表達新疆地區(qū)流行的優(yōu)勢強毒結(jié)核分枝桿菌菌株組分別感染小鼠腹腔巨噬細胞后24h、96h,同時設(shè)未過表達的H37Rv菌株、H37Ra菌株和新疆地區(qū)流行的優(yōu)勢強毒結(jié)核分枝桿菌菌株組作為對照;分別對各組細胞的裂解物進行細菌培養(yǎng),菌落計數(shù),觀察各組細菌在小鼠腹腔巨噬細胞內(nèi)的增殖能力。結(jié)果:1.應用電穿孔技術(shù)分別將各重組穿梭質(zhì)粒導入不同毒力菌株,經(jīng)藥物篩選、應用QRT-PCR技術(shù)檢測及鑒定已構(gòu)建的各過表達菌株,確定各過表達菌株中各基因的過表達水平,確保目的基因在各菌株上均有不同程度的表達;2.Annexin V-FITC/PI雙染法檢測各結(jié)核分枝桿菌感染巨噬細胞的凋亡結(jié)果顯示:H37Ra::Pup;H37Ra::Mpa;H37Ra::Dop;H37Ra::paf A菌株分別感染巨噬細胞組,各菌株感染巨噬細胞的凋亡率在1h、6h、12h和24h呈上升趨勢;上述各菌株感染巨噬細胞組分別與H37Ra菌株感染巨噬細胞組相比較,各菌株感染巨噬細胞的凋亡率,在同一時間點其凋亡率均降低。H37Rv::Pup;H37Rv::Mpa;H37Rv::Dop;H37Rv::paf A菌株分別感染巨噬細胞組,各菌株感染巨噬細胞的凋亡率在1h、6h、12h和24h呈上升趨勢;上述各菌株感染巨噬細胞組分別與H37Rv菌株感染巨噬細胞組比較,各菌株感染巨噬細胞的凋亡率,在同一時間點其凋亡率均降低。XJ::Pup;XJ::Mpa;XJ::Dop;XJ::paf A菌株分別感染巨噬細胞組,各菌株感染巨噬細胞的凋亡率在1h、6h、12h和24h呈上升趨勢,;上述各菌株感染巨噬細胞組分別與優(yōu)勢株菌株對照組感染巨噬細胞組比較,各菌株感染巨噬細胞的凋亡率,在同一時間點其凋亡率均降低。與H37Ra::Pup;H37Ra::Mpa;H37Ra::Dop;H37Ra::paf A菌株分別感染巨噬細胞組相比較,H37Rv::Pup;H37Rv::Mpa;H37Rv::Dop;H37Rv::paf A菌株分別感染巨噬細胞組后各菌株感染巨噬細胞的凋亡率,在同一時間點其凋亡率均降低;XJ::Pup;XJ::Mpa;XJ::Dop;XJ::paf A菌株分別感染巨噬細胞組其各菌株感染巨噬細胞的凋亡率,在同一時間點其凋亡率均降低。3.各過表達菌株組分別感染小鼠腹腔巨噬細胞,同時設(shè)未過表達的H37Rv菌株、H37Ra菌株和新疆優(yōu)勢強毒結(jié)核分枝桿菌菌株組作為對照;CFU菌落計數(shù)檢測結(jié)果顯示:各Pup/Mpa/Dop/paf A基因過表達結(jié)核分枝桿菌H37Ra菌株、Pup/Mpa/Dop/paf A基因過表達結(jié)核分枝桿菌H37Rv菌株和Pup/Mpa/Dop/paf A基因過表達新疆地區(qū)流行的優(yōu)勢強毒結(jié)核分枝桿菌菌株組分別感染RAW264.7細胞,上述各菌株組感染RAW264.7細胞后96h實驗組和對照組細胞裂解物細菌培養(yǎng)菌落計數(shù),結(jié)果顯示:上述Pup/Mpa/Dop/paf A過表達的各結(jié)核分枝桿菌菌株組的細胞裂解物的菌落計數(shù)均顯著高于Pup/Mpa/Dop/paf A未過表達的對照組,其在巨噬細胞內(nèi)的增殖能力明顯增強。結(jié)論:1.成功構(gòu)建Pup/Mpa/Dop/paf A基因過表達結(jié)核分枝桿菌H37Ra菌株、Pup/Mpa/Dop/paf A基因過表達結(jié)核分枝桿菌H37Rv菌株和Pup/Mpa/Dop/paf A基因過表達新疆地區(qū)流行的優(yōu)勢強毒結(jié)核分枝桿菌菌株;2.不同毒力的結(jié)核分枝桿菌感染巨噬細胞,誘導巨噬細胞凋亡水平不同可能與它們誘導產(chǎn)生的Pup、Mpa、Dop、paf A基因的表達水平不同有關(guān);3.Pup/Mpa/Dop/paf A基因過表達可以增強H37Ra菌株、H37Rv菌株和新疆地區(qū)流行的優(yōu)勢強毒結(jié)核分枝桿菌菌株的毒性及其致病性。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：石河子大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R52;R446.5

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本文編號：1570190