本文關(guān)鍵詞： 虎杖苷 放射性肺損傷 放射性肺炎 放射性肺纖維化 上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化 羥自由基 肺部荷瘤 活體成像 腫瘤抑制　出處：《第二軍醫(yī)大學(xué)》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：課題背景:放射性肺損傷常發(fā)生于胸部腫瘤放射治療和核事故、核武器襲擊等事件造成的急性全身放射中。放射性肺損傷的主要臨床表現(xiàn)為肺泡間質(zhì)的炎性浸潤(rùn)、進(jìn)行性呼吸困難、肺功能惡化并最終導(dǎo)致呼吸功能衰竭。放射性肺損傷的發(fā)生,極大程度上降低了接受胸部照射病人的預(yù)后生存率。目前臨床上,除了使用腎上腺皮質(zhì)激素對(duì)癥治療外,尚無有效的治療藥物。放射性肺損傷的發(fā)生原因,學(xué)術(shù)界并未有統(tǒng)一的結(jié)論。主流觀點(diǎn)認(rèn)為,其主要發(fā)病機(jī)制為電離輻射誘導(dǎo)的多種炎癥細(xì)胞、成纖維細(xì)胞及其相關(guān)的細(xì)胞因子免疫失衡,造成成纖維細(xì)胞過度增殖遷移和細(xì)胞外間質(zhì)(ECM)沉積有關(guān),同時(shí),羥自由基受到電離輻射的激發(fā),從而對(duì)機(jī)體產(chǎn)生了損傷。目前,對(duì)于放射性肺損傷的臨床治療,尚缺乏理想的特效藥物。傳統(tǒng)的放射防護(hù)藥物在正常肺組織發(fā)揮放射防護(hù)作用的同時(shí),對(duì)腫瘤細(xì)胞也提供了一定的防護(hù)效果。該藥物特點(diǎn)極大地降低了腫瘤放療的效果,制約了其在臨床腫瘤病人胸部放療中的應(yīng)用。因此,在放射性肺損傷的臨床治療中,迫切地需要尋找一種療效顯著、毒副作用小、安全性高的新型防護(hù)藥物�；⒄溶�(Polydatin,PD),是在自然界廣泛存在的一種天然活性成份,廣泛存在于中藥虎杖的根和莖�；⒄溶諄碓磸V泛,具有明確的分子結(jié)構(gòu),易于人工合成,價(jià)格低廉,目前已廣泛應(yīng)用于人體的日常保健中�；⒄溶帐且环N強(qiáng)效的自由基清除劑,同時(shí)具有抗炎、抗氧化、保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞的作用。除此之外,更令我們感興趣的是,虎杖苷還對(duì)多種人體腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生殺傷作用。該藥物的半數(shù)致死劑量超過1000mg/kg,遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于其治療劑量,毒副作用小,表現(xiàn)出較好的生物安全性。結(jié)合虎杖苷的特點(diǎn),我們認(rèn)為,該藥物在臨床胸部腫瘤放射治療等原因所致的放射性肺損傷中存在著巨大的潛在價(jià)值。研究主要內(nèi)容:1、虎杖苷對(duì)放射性肺損傷的防護(hù)作用:(1)虎杖苷對(duì)電離輻射誘導(dǎo)的肺組織大體及肺系數(shù)改變的影響;(2)虎杖苷對(duì)電離輻射誘導(dǎo)肺組織病理學(xué)改變的影響;(3)虎杖苷對(duì)電離輻射誘導(dǎo)的上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響;(4)虎杖苷對(duì)電離輻射誘導(dǎo)的肺上皮細(xì)胞損傷的影響。2、虎杖苷的防護(hù)機(jī)制:(1)虎杖苷對(duì)TGF-β1/Smad3/Snail通路的影響;(2)虎杖苷對(duì)促纖維化因子TGF-β1及ET-1分泌的影響;(3)虎杖苷對(duì)th1/th2細(xì)胞免疫失衡的影響;(4)虎杖苷對(duì)放射性肺損傷相關(guān)炎性細(xì)胞因子分泌的影響;(5)虎杖苷對(duì)羥自由基、sod、mda表達(dá)水平的影響;(6)虎杖苷對(duì)潛在靶點(diǎn)sirt蛋白家族表達(dá)的影響。3、虎杖苷對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用:(1)小鼠肺部荷瘤模型的建立;(2)虎杖苷對(duì)荷瘤小鼠生存率的影響;(3)虎杖苷對(duì)荷瘤小鼠肺組織大體改變的影響;(4)虎杖苷對(duì)荷瘤小鼠肺組織病理學(xué)改變的影響;(5)虎杖苷對(duì)肺癌細(xì)胞的抑制作用。實(shí)驗(yàn)研究方法:1、建立小鼠放射性肺損傷模型:使用本教研室自行設(shè)計(jì)的c57bl/6小鼠模具固定,使小鼠四肢充分伸展,暴露小鼠口鼻于模具外側(cè),選取回形針作為固定工具,分別固定小鼠的四肢及尾部。用鉛磚遮擋小鼠胸部以外區(qū)域后,采用15gy大劑量單次照射,劑量率1gy/min。2、虎杖苷對(duì)放射性肺損傷的防護(hù)作用:(1)動(dòng)物分組及處理:將120只c57bl/6雌性小鼠隨機(jī)分為4組,即對(duì)照組、單純照射組、虎杖苷處理組、wr2721處理組,分別進(jìn)行相應(yīng)的處理;(2)對(duì)比接受電離輻射后,各組小鼠肺組織大體及肺系數(shù)改變情況;(3)病理組織變化情況:分別對(duì)各組小鼠肺組織進(jìn)行he染色、masson’strichrome染色、免疫組化染色、tunel染色;(4)肺組織上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化(emt)情況對(duì)比:通過westernblot及免疫熒光染色的方法,檢測(cè)肺組織間質(zhì)標(biāo)志物α-肌動(dòng)蛋白(α-sma)、波形蛋白(vimentin)以及上皮標(biāo)志物e-鈣黏素(e-cadherin)表達(dá)的變化情況;(5)比色法檢測(cè)肺組織中羥脯氨酸(hydroxyproline,hyp)的表達(dá)情況;(6)細(xì)胞處理:選取人支氣管上皮細(xì)胞beas-2b,檢測(cè)虎杖苷是否對(duì)電離輻射誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷具有防護(hù)作用;(7)細(xì)胞增殖能力檢測(cè):cck-8、克隆形成率。3、虎杖苷的防護(hù)機(jī)制:(1)用免疫組化染色,檢驗(yàn)虎杖苷對(duì)tgf-β1/smad3/snail通路的作用;(2)用elisa的方法,檢測(cè)肺組織tgf-β1、et-1、ifn-γ、il-4、il-13、pge2、tnf-α等細(xì)胞因子的表達(dá)情況;(3)用esr的方法,檢測(cè)虎杖苷對(duì)于羥自由基的清除能力;(4)檢測(cè)虎杖苷對(duì)于肺組織中sod、mda表達(dá)量的影響;(5)細(xì)胞處理:選取人支氣管上皮細(xì)胞beas-2b,檢測(cè)虎杖苷對(duì)細(xì)胞內(nèi)sirt家族蛋白表達(dá)的影響。4、虎杖苷對(duì)肺癌細(xì)胞的抑制作用:(1)建立小鼠肺部荷瘤模型:使用dmem培養(yǎng)基重懸吹勻小鼠路易斯肺癌細(xì)胞llc,配制成2×106濃度的細(xì)胞懸液后備用。用10%水合氯醛麻醉小鼠后,使其左側(cè)臥于手術(shù)臺(tái)上并固定。消毒后,于小鼠胸骨劍突右側(cè)10mm處,切開皮膚并剝離右側(cè)胸壁前肌層,暴露小鼠胸腔壁層及肋間隙,可見其活動(dòng)的右下肺葉。在肉眼直視狀態(tài)下,通過小鼠右下第一或第二肋間隙垂直進(jìn)針,進(jìn)針深度5mm,注射細(xì)胞懸液25μl。逐層縫合小鼠肌層及皮膚,再次消毒,并使其復(fù)溫蘇醒;(2)通過大體觀察,對(duì)比虎杖苷處理組與對(duì)照組肺部腫瘤組織的生長(zhǎng)情況;(3)通過病理切片,對(duì)比虎杖苷處理組與對(duì)照組肺部腫瘤組織的生長(zhǎng)情況;(4)通過活體成像,對(duì)比虎杖苷處理組與對(duì)照組肺部腫瘤組織的生長(zhǎng)情況;(5)在細(xì)胞學(xué)水平,驗(yàn)證虎杖苷對(duì)肺部腫瘤細(xì)胞的抑制作用。技術(shù)路線:實(shí)驗(yàn)結(jié)果:1、虎杖苷對(duì)放射性肺損傷的防護(hù)作用:(1)肺組織大體觀察與肺系數(shù)對(duì)比顯示,虎杖苷能夠顯著減輕電離輻射誘導(dǎo)的肺部出血、充血、水腫程度,從而控制肺系數(shù)的上升;(2)對(duì)比he染色、masson染色和tunel染色結(jié)果,虎杖苷在肺組織受照早期和晚期,均表現(xiàn)出明顯的炎癥抑制、纖維素滲出抑制作用,同時(shí)可顯著抑制電離輻射誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡;(3)羥脯氨酸含量檢測(cè)顯示,虎杖苷對(duì)于電離輻射誘導(dǎo)的羥脯氨酸升高具有顯著的抑制作用;(4)免疫熒光與westernblot結(jié)果顯示,虎杖苷對(duì)于電離輻射誘導(dǎo)的emt有顯著的抑制作用;(5)細(xì)胞學(xué)結(jié)果顯示,虎杖苷對(duì)于電離輻射誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡具有顯著的抑制作用。2、虎杖苷的防護(hù)機(jī)制:(1)免疫組化結(jié)果顯示,虎杖苷對(duì)于促纖維化作用的tgf-β1/smad3/snail通路有著顯著的抑制效果;(2)虎杖苷顯著地抑制了促纖維化因子tgf-β1和et-1的升高;(3)在虎杖苷處理組,th1和th2細(xì)胞免疫失衡引發(fā)相應(yīng)細(xì)胞因子的升高受到了顯著的抑制,提示虎杖苷對(duì)于電離輻射誘導(dǎo)的th1/th2細(xì)胞免疫失衡具有一定的調(diào)節(jié)作用;(4)虎杖苷能夠延緩pge2的下降,同時(shí)顯著抑制tnf-α的升高,提示虎杖苷具有較強(qiáng)的抗炎作用;(5)虎杖苷具有顯著的抗氧化能力,能夠迅速地清除大量羥自由基、抑制肺組織內(nèi)sod的下調(diào)與mda的上調(diào);(6)虎杖苷對(duì)sirt蛋白具有顯著的激動(dòng)效果,尤其對(duì)于sirt3、sirt6的激動(dòng)效果更為顯著,提示sirt蛋白可能是虎杖苷潛在的作用靶點(diǎn)。3、虎杖苷對(duì)于肺癌細(xì)胞的抑制作用:(1)成功建立了小鼠肺部荷瘤模型;(2)虎杖苷能夠顯著提高荷瘤小鼠的生存率;(3)虎杖苷能夠顯著延緩肺部腫瘤的生長(zhǎng);(4)虎杖苷對(duì)于腫瘤細(xì)胞存在一定的抑制作用。結(jié)論:虎杖苷能夠有效緩解電離輻射誘導(dǎo)的肺組織病理改變,減輕肺水腫,抑制上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化的過程,從而對(duì)電離輻射誘導(dǎo)的放射性肺損傷產(chǎn)生防護(hù)效應(yīng)。細(xì)胞學(xué)水平上,虎杖苷顯示出同樣的防護(hù)效果。虎杖苷可能通過抑制TGF-β1/Smad3/Snail通路、減少促纖維化因子和炎性細(xì)胞因子的釋放、調(diào)節(jié)Th1/Th2細(xì)胞免疫失衡、提高體內(nèi)Sirt蛋白的表達(dá)、抗炎抗氧化等方式,發(fā)揮其放射性肺損傷的防護(hù)作用。本研究成功建立了建立了小鼠肺部荷瘤模型,并通過該模型,證明了虎杖苷能夠顯著提高荷瘤小鼠的生存率、延緩肺部腫瘤的生長(zhǎng)、同時(shí)對(duì)于腫瘤細(xì)胞存在一定的抑制作用。綜上所述,虎杖苷具有高效低毒、價(jià)格低廉、抗炎抗氧化、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫反應(yīng)的特點(diǎn),同時(shí)又能夠延長(zhǎng)肺部荷瘤小鼠的生存時(shí)間、延緩腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育,在臨床肺癌放療中存在著巨大的潛在價(jià)值。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R730.55

【參考文獻(xiàn)】

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1 楊s，

本文編號(hào)：1542833