本文關(guān)鍵詞：胡黃連苷Ⅱ?qū)毙阅摱拘愿螕p傷小鼠的保護及機制研究　出處：《第二軍醫(yī)大學(xué)》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：研究目的膿毒癥所致的多臟器功能衰竭(MOF),在危重癥醫(yī)學(xué)領(lǐng)域仍是危害人類健康的重大難題,而膿毒性肝損傷目前在臨床上病死率一直居高不下。因此亟待探索其發(fā)病機制和有效的治療藥物以改善預(yù)后。胡黃連苷Ⅱ(Picroside II,Pic II)的抗炎、抗細胞凋亡等藥理作用目前已得到公認,而對膿毒性肝損傷研究甚少。本課題擬通過腹腔注射脂多糖/D-氨基半乳糖苷(LPS/D-GalN)構(gòu)建經(jīng)典的急性肝損傷(ALI)動物模型,采用熒光定量PCR、流式細胞術(shù)、酶聯(lián)免疫吸附實驗等實驗技術(shù),觀察胡黃連苷Ⅱ?qū)毙阅摱拘愿螕p傷的保護作用;體外實驗探討胡黃連苷Ⅱ抗細胞凋亡、焦亡的作用機制。研究方法1.胡黃連苷Ⅱ?qū)PS/D-GalN誘導(dǎo)的小鼠急性膿毒性肝損傷的影響(1)C57BL/6雄性小鼠40只,隨機分為生理鹽水(NS)組,ALI組、ALI+PicⅡ組、PicⅡ組,每組10只。ALI+PicⅡ組及PicⅡ組分別于LPS/D-GalN注射前24h,12h,6h,1h四個時間點腹腔注射20mg/kg胡黃連苷Ⅱ,NS組和ALI組同時間同劑量腹腔注射NS;接下來ALI+PicⅡ組與ALI組腹腔注射LPS10μg/只和D-GalN 800mg/kg,NS組和Pic II組腹腔注射等劑量的NS,觀察造模后16h內(nèi)小鼠生存率。(2)C57BL/6雄性小鼠12只,分為上述4組,每組3只。處理同上,于造模后5h眼球靜脈采血,頸脫臼處死小鼠。分別檢測血清炎癥因子TNF-α、IL-6,ALT、AST水平;觀察各組小鼠肝組織大體形態(tài),肝HE染色,檢測肝組織TNF-α、IL-6mRNA表達水平,綜合評價各組肝功能狀態(tài)。提取各組剩余肝組織的肝細胞,流式細胞術(shù)(FCM)檢測Annexin V-PE,caspase-1-FITC,7AAD的熒光強度變化;羅丹明123檢測線粒體膜電位變化;Western Blot檢測caspase-3活化水平,pro-caspase-1,caspase-1(p20)蛋白的表達。2.胡黃連苷Ⅱ抗凋亡、焦亡的作用機制(1)提取C57BL/6雄性小鼠腹腔巨噬細胞,分為對照組(A組),胡黃連苷Ⅱ組(B組),LPS組(C組),LPS+胡黃連苷Ⅱ組(D組)。Western Blot檢測pJNK、Bcl-2/Bax表達,探索Pic II抗細胞凋亡的分子機制。(2)提取C57BL/6雄性小鼠腹腔巨噬細胞,分為對照組(E組),胡黃連苷Ⅱ組(F組),LPS+ATP組(G組),LPS+ATP+胡黃連苷Ⅱ組(H組)。ELISA檢測上清IL-1β、IL-18水平;Western Blot檢測pro-caspase-1,caspase-1(p20),NLRP3、ASC變化,探索Pic II抗細胞焦亡的分子機制。研究結(jié)果1.與NS組相比,ALI組小鼠16h生存率明顯下降,ALI+PicⅡ組較ALI組升高。血清TNF-α、IL-6,ALT、AST含量,肝組織TNF-α、IL-6 mRNA在ALI組表達顯著升高(P0.05);ALI+PicⅡ組上述各指標比ALI組下降(P0.05),ALI+PicⅡ組比PicⅡ組高(P0.05)。2.肝臟外觀:ALI組肝臟腫大,被膜緊張,明顯淤血和出血,而ALI+PicⅡ組僅為輕度淤血。肝臟病理切片經(jīng)HE染色顯示ALI組肝細胞壞死,大量炎癥細胞浸潤和充血,ALI+PicⅡ組則表現(xiàn)為輕度的病理改變。肝細胞經(jīng)Annexin V/7AAD染色后,ALI組肝細胞凋亡率明顯高于NS組(P0.05),ALI+PicⅡ組較ALI組凋亡率下降(P0.05)。羅丹明123染色顯示ALI組陽性率明顯高于NS組(P0.05),ALI+PicⅡ組陽性率低于PicII組(P0.05)。經(jīng)caspase-1/7AAD染色結(jié)果顯示:ALI組肝細胞的焦亡率明顯高于NS組(P0.05),ALI+PicⅡ組較ALI組下降,但高于PicⅡ組(P0.05)。四組pro-caspase-3表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),ALI組活化的caspase-3明顯高于NS組(P0.05),ALI+PicⅡ組高于PicⅡ組(P0.05);各組pro-caspase-1表達含量無統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05)。ALI組活化的caspase-1表達明顯高于NS組(P0.05),ALI+PicⅡ組高于PicⅡ組(P0.05)。3.體外細胞實驗:細胞凋亡模型經(jīng)胡黃連苷II干預(yù)后顯示:B組p-JNK明顯高于A組,C組比B組下降,C組比D組表達增高(P0.05);B組Bcl-2/Bax明顯低于A組,C組比B組升高,C組比D組表達增高(p0.05);細胞焦亡模型經(jīng)胡黃連苷II干預(yù)后顯示:F組細胞上清IL-1β、IL-18濃度明顯高于E組(P0.05),G組低于F組(P0.05)。Western Blot檢測NLRP3,ASC,caspase-1(p20)變化:F組明顯高于E組(P0.05),G組比F組下降(P0.05),G組比H組高(P0.05)。結(jié)論1.胡黃連苷Ⅱ抑制LPS/D-GalN誘導(dǎo)的小鼠肝損傷的炎癥反應(yīng),減輕肝細胞的凋亡和焦亡,改善膿毒癥小鼠肝損傷,降低膿毒癥小鼠肝損傷的死亡率。2.胡黃連苷Ⅱ抑制凋亡的機制可能是通過線粒體內(nèi)源性途徑抑制Bax,促進Bcl-2表達,從而抑制caspase-3活性;抑制細胞焦亡的可能機制為通過抑制NLRP3炎性小體的活化,從而抑制IL-1β和IL-18釋放,保護急性膿毒性肝損傷。
[Abstract]:The effects of picroside 鈪，

本文編號：1374023