本文關(guān)鍵詞：CTX-M型超廣譜β-內(nèi)酰胺酶在肺炎克雷伯菌中的分子進(jìn)化機(jī)制研究

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【摘要】：背景與目的肺炎克雷伯菌為臨床感染中常見的革蘭陰性桿菌之一。由于該菌易引起臨床條件致病以及菌株多具有多重耐藥性,其已成為臨床抗感染治療中的主要難點(diǎn)之一。肺炎克雷伯菌的臨床分離率以在ICU和呼吸內(nèi)科為高,主要感染施行氣管插管或配備呼吸機(jī)的免疫力低下的患者。隨著廣譜β-內(nèi)酰胺類藥物以及碳青霉烯類藥物的使用,多重耐藥的肺炎克雷伯菌,尤其是攜帶超廣譜β-內(nèi)酰胺酶或碳青霉烯酶的菌株,在臨床中的檢出率也是逐年升高。而且在抗菌藥物的選擇壓力下,新型別耐藥基因的產(chǎn)生、傳播和流行,使得耐藥菌感染患者不能得到抗菌藥物及時(shí)有效的治療,延誤了病人病情,增加了醫(yī)療成本。因此,對新型別耐藥基因的研究、檢測,遏制耐藥基因進(jìn)一步的進(jìn)化與傳播,成為耐藥細(xì)菌研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。CTX-M型ESBLs近年來已經(jīng)超過TEM型及SHV型,成為革蘭陰性桿菌中流行最為廣泛的超廣譜β-內(nèi)酰胺酶,攜帶CTX-M型ESBLs也是肺炎克雷伯菌產(chǎn)生耐藥的主要分子機(jī)制之一。CTX-M型ESBLs對頭孢類抗菌藥物具有較高的水解活性,并且其由質(zhì)粒攜帶傳播的特點(diǎn),也利于CTX-M型ESBLs新型別的產(chǎn)生、傳播與流行。并且此類菌株往往涉及其他多種耐藥機(jī)制,產(chǎn)生的多重耐藥菌在臨床抗菌藥物的選擇壓力下,較一般菌株能夠更快地進(jìn)化、適應(yīng)與流行。鑒于耐藥基因的快速演化及耐藥菌株的廣泛流行,明確CTX-M型ESBLs的進(jìn)化路徑,預(yù)測未來可能出現(xiàn)的耐藥基因新型別,成為了當(dāng)前研究的重要內(nèi)容之一�；诨驕y序技術(shù)與生物信息學(xué)的快速發(fā)展,依靠基因序列生物計(jì)算學(xué)分析的細(xì)菌進(jìn)化研究也有了長足的進(jìn)步。收集海量的臨床耐藥菌株,經(jīng)由基因測序技術(shù),可建立起一系列耐藥基因的存儲數(shù)據(jù)庫。而生物信息學(xué)軟件的開發(fā)為大規(guī)模基因序列的分析提供了高效精準(zhǔn)的工具。利用基因序列的生物信息學(xué)分析,已經(jīng)構(gòu)建了諸如SHV型和TEM型ESBLs的全球范圍內(nèi)的進(jìn)化圖譜,并且通過基因序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹的方法,發(fā)現(xiàn)了CTX-M型ESBLs的起源與分化。然而單純依靠基因序列相似性而確立的進(jìn)化關(guān)系,并不能真實(shí)可靠的反映臨床抗菌藥物選擇壓力下,耐藥基因間準(zhǔn)確的進(jìn)化關(guān)系。只有建立在臨床資料上的進(jìn)化分析,才能建立臨床用藥情況下耐藥基因的進(jìn)化路徑。另一方面,基于實(shí)驗(yàn)室模擬方法下進(jìn)化路徑的構(gòu)建,同樣是目前研究的熱點(diǎn)。其中西班牙進(jìn)化生物學(xué)家Angela Novais憑借實(shí)驗(yàn)室中抗菌藥物Darwin選擇的方法,構(gòu)建出了CTX-M-1型ESBLs的進(jìn)化圖譜。然而基于實(shí)驗(yàn)室模擬的方法,并不能完全還原臨床用藥下微環(huán)境的改變,因此其結(jié)果并不能指導(dǎo)臨床的用藥方案。為解決上述問題,我們設(shè)計(jì)了本課題,旨在通過臨床資料與生物信息學(xué)分析相結(jié)合的方式,并參考之前實(shí)驗(yàn)室模擬的結(jié)果,對河南地區(qū)CTX-M型ESBLs進(jìn)行進(jìn)化路徑的分析,明確本地區(qū)CTX-M型ESBLs攜帶株的耐藥表型與其耐藥基因型別,構(gòu)建河南地區(qū)CTX-M型ESBLs的進(jìn)化路徑,預(yù)測未來可能產(chǎn)生的新型耐藥基因型別,為臨床抗感染治療提供可靠的參考依據(jù)。方法(1)菌株收集收集2014年8月至11月間,鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科微生物室所分離的耐頭孢類抗菌藥物的肺炎克雷伯菌共72株,所有菌株均采用VitekⅡCompact鑒定至種。(2)菌株藥敏分析及ESBLs表型確證試驗(yàn)參照CLSI 2014年標(biāo)準(zhǔn)對藥敏實(shí)驗(yàn)與表型確證試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析。(3)常見耐藥基因擴(kuò)增與基因型別鑒定采用普通PCR方法對常見的ESBLs編碼基因以及碳青霉烯酶編碼基因進(jìn)行擴(kuò)增,并且進(jìn)行測序得到基因型別。(4)耐藥菌株同源性分析利用RAPD-PCR方法對CTX-M型ESBLs攜帶菌株以及碳青霉烯酶攜帶菌株進(jìn)行菌株同源性分析。(5)CTX-M型ESBLs進(jìn)化路徑分析采用局部序列比對、構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹、正選擇位點(diǎn)分析以及蛋白質(zhì)三維構(gòu)象分析等生物信息學(xué)方法分析CTX-M型ESBLs的進(jìn)化路徑。結(jié)果1.肺炎克雷伯菌ESBLs檢出情況檢出CTX-M型ESBLs陽性菌株60株,其中包括CTX-M-3、CTX-M-15、CTX-M-55、CTX-M-9、CTX-M-14、CTX-M-27以及CTX-M-65共7種不同CTX-M型別。而攜帶CTX-M型ESBLs的菌株同時(shí)也攜帶SHV、TEM以及OXA-10三種其他型別的ESBLs,并且有21株CTX-M型ESBLs攜帶菌株同時(shí)攜帶有KPC-2型或NDM-1型碳青霉烯酶。2.CTX-M型ESBLs的進(jìn)化路徑本地區(qū)檢出CTX-M-3→CTX-M-15→CTX-M-55進(jìn)化路徑,并且第80位及第242位氨基酸為正選擇位點(diǎn),突變位點(diǎn)所在的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域影響CTX-M-3組ESBLs的水解活性。而所檢出的CTX-M-14組ESBLs并未檢出明確的進(jìn)化路徑。3.同時(shí)攜帶CTX-M-65型ESBLs與KPC-2型碳青霉烯酶的耐藥菌株本次研究首次在河南地區(qū)發(fā)現(xiàn)CTX-M-65型ESBLs,CTX-M-65型ESBLs與CTX-M-14型ESBLs相比,在第80位與第275位氨基酸發(fā)生突變。并且此次發(fā)現(xiàn)的CTX-M-65型ESBLs攜帶株均同時(shí)攜帶有KPC-2型碳青霉烯酶。結(jié)論1.CTX-M型ESBLs攜帶菌株,同時(shí)攜帶其他類型ESBLs乃至碳青霉烯酶。建議臨床抗肺炎克雷伯菌感染治療時(shí),應(yīng)當(dāng)合理應(yīng)用β-內(nèi)酰胺類藥物,注意與其他抗菌藥物聯(lián)合使用。2.本地區(qū)存在CTX-M-3→CTX-M-15→CTX-M-55進(jìn)化路徑,預(yù)示沿此路徑將出現(xiàn)新型別的CTX-M型ESBLs。提示臨床應(yīng)加強(qiáng)CTX-M基因的監(jiān)測與防控工作,避免耐藥基因進(jìn)一步進(jìn)化傳播。3.本地區(qū)首次檢測出CTX-M-65型ESBLs,預(yù)示本地區(qū)存在新的CTX-M型ESBLs的進(jìn)化起點(diǎn)。提示應(yīng)加強(qiáng)新型別ESBLs的監(jiān)測與防控工作,防止院內(nèi)耐藥基因的傳播與流行。
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R446.5

【參考文獻(xiàn)】

中國博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 陳振鴻;質(zhì)粒編碼的超廣譜β-內(nèi)酰胺酶CTX-M-55及碳青霉烯酶NDM-1和IMP-1的分子遺傳特征研究[D];中國人民解放軍醫(yī)學(xué)院;2014年

中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 季淑娟;大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌CTX-M型ESBLs研究[D];浙江大學(xué);2004年

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本文編號：1218547