本文關(guān)鍵詞：曲霉菌實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)體系的建立

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【摘要】：目的:旨在建立曲霉菌屬實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time fluorescent quantitative PCR,FQ-PCR)檢測(cè)體系,以實(shí)現(xiàn)快速、準(zhǔn)確、特異地檢測(cè)臨床侵襲性真菌感染中常見(jiàn)的曲霉菌屬病原菌,主要包括煙曲霉菌、黃曲霉菌、黑曲霉菌、土曲霉菌,為曲霉菌屬PCR檢測(cè)試劑盒的開(kāi)發(fā)提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。方法:于中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)購(gòu)買(mǎi)真菌標(biāo)準(zhǔn)株,經(jīng)適合條件培養(yǎng)后制成200mg左右的真菌固體組織標(biāo)本及濃度約為105個(gè)孢子/mL的孢子混懸液標(biāo)本,分別用液氮研磨法、一步裂解加熱法兩種方法提取兩種標(biāo)本DNA,存在冰箱備用。在基因庫(kù)(NCBI)中分別下載多種真菌、細(xì)菌、病毒以及人類(lèi)基因序列,通過(guò)比對(duì)找出四種曲霉菌:煙曲霉菌、黃曲霉菌、黑曲霉菌、土曲霉菌各自的特異性區(qū)域,利用Primer Premier 5.0和Beacon Designer 7.7設(shè)計(jì)引物探針,并通過(guò)FQ-PCR檢測(cè)篩選最佳引物探針,通過(guò)對(duì)比液氮研磨法、一步裂解加熱法方法提取曲霉菌DNA的效率及擴(kuò)增效果,尋找適合FQ-PCR檢測(cè)的曲霉菌DNA提取的方法,驗(yàn)證反應(yīng)體系的特異性、重復(fù)性,并分析各自反應(yīng)的靈敏度,建立出特異性、重復(fù)性好、靈敏度高的檢測(cè)體系。結(jié)果:曲霉菌以三點(diǎn)三角式接種于SDA培養(yǎng)基,在37°C培養(yǎng)箱中生長(zhǎng)3-4天,生長(zhǎng)良好,能觀察到不同菌落形態(tài)。用液氮研磨法與一步結(jié)合加熱法提取曲霉菌的DNA并進(jìn)行熒光定量PCR對(duì)比曲線,結(jié)果提示液氮研磨法與一步結(jié)合加熱法提取的DNA行的熒光定量PCR皆為典型“S”型,以?xún)蓸颖総檢驗(yàn)比較不同提取方法的Ct值,P0.05,無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。下載篩選出最佳引物探針,以此引物探針在相同條件、對(duì)同類(lèi)型樣本行熒光定量PCR,曲線均呈典型“S”型,并對(duì)建成的反應(yīng)體系進(jìn)行特異性檢測(cè),未見(jiàn)特異性擴(kuò)增,批內(nèi)、批間重復(fù)性實(shí)驗(yàn)的Ct值變異系數(shù),結(jié)果均小于5%(在0.37%至3.53%之間),四種曲霉菌的靈敏度均至少可達(dá)到約35個(gè)孢子/mL。結(jié)論:1.對(duì)于真菌固體組織標(biāo)本,液氮研磨法提取DNA濃度、純度高,對(duì)于曲霉菌標(biāo)準(zhǔn)株培養(yǎng)的孢子沖洗標(biāo)本,一步結(jié)合加熱法提取曲霉菌DNA操作簡(jiǎn)單、能有效的運(yùn)用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)。2.成功設(shè)計(jì)篩選出煙曲霉菌、黃曲霉菌、土曲霉菌、黑曲霉菌的引物探針,建立了曲霉菌實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)體系,其檢測(cè)體系特異性高、靈敏性及重復(fù)性好。
【學(xué)位授予單位】：湖南師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：R440

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