本文關(guān)鍵詞：血清葉酸及其相關(guān)代謝產(chǎn)物超高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法建立及應(yīng)用研究

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【摘要】：背景:葉酸(folic acid,FA)是一種B族維生素,本身無生理功能,在體內(nèi)二氫葉酸還原酶的作用下轉(zhuǎn)變成二氫葉酸及四氫葉酸(tetrahydrofolate,THF),四氫葉酸是葉酸的活性形式,可作為一碳單位的載體參與體內(nèi)的一碳單位代謝,生成甲基四氫葉酸,亞甲基四氫葉酸,次甲基四氫葉酸和甲酰四氫葉酸。通過一碳單位形式實(shí)現(xiàn)其生物效應(yīng),參與嘌呤和嘧啶單核苷酸的合成,通過S-腺苷蛋氨酸(S-adenosly methionine,SAM)循環(huán)為體內(nèi)蛋白質(zhì)、核酸等物質(zhì)的甲基化反應(yīng)提供甲基。因此,葉酸與體內(nèi)的核酸代謝及調(diào)節(jié),能量物質(zhì)代謝及代謝調(diào)節(jié)等多種生理功能有著密切的關(guān)系。流行病學(xué)及實(shí)驗(yàn)研究表明,葉酸缺乏及代謝障礙嚴(yán)重影響人類健康,導(dǎo)致多種嚴(yán)重疾病,如出生缺陷、神經(jīng)精神疾病、心血管疾病、腫瘤等,但其機(jī)制尚不清楚。所以,目前葉酸與人類健康的關(guān)系及其致病機(jī)理是基礎(chǔ)科學(xué)和臨床科學(xué)關(guān)注的重大課題。建立準(zhǔn)確、高效、方便的測定葉酸及其代謝產(chǎn)物(葉酸、5-甲基四氫葉酸(5-methyltetrahydrofolate,5-MeTHF)、5-甲酰四氫葉酸(5-formyltetrahydrofolate,5-FoTHF)、同型半胱氨酸(homocysteine,Hcy)、S-腺苷蛋氨酸、S-腺苷同型半胱氨酸(S-adenosyl homocysteine,SAH))的方法是進(jìn)行葉酸研究的重要基礎(chǔ)手段。目前,關(guān)于葉酸及其代謝產(chǎn)物的測定方法尚無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。常使用的方法包括比色法,薄層層析法,毛細(xì)管電泳法,微生物檢測法,同位素放射免疫分析法,氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法以及高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法等。以上方法在不同程度上存在耗時長,樣本量大,靈敏度低等缺點(diǎn),尚不能滿足科研和臨床應(yīng)用需要。本研究針對前述方法存在的缺點(diǎn),利用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(ultra high performance liquid chromatograpy-tandem mass spectrometer,UPLC-MS/MS)進(jìn)行葉酸及相關(guān)代謝產(chǎn)物在不同樣品中的測定和研究,擬建立一個高效、簡便、靈敏且適用范圍廣泛的葉酸及相關(guān)代謝產(chǎn)物的檢測手段。目的:研究和探索使用uplc-ms/ms技術(shù)測定血清和組織中葉酸及其相關(guān)代謝產(chǎn)物的可行性及檢測條件,優(yōu)化并建立一種葉酸及代謝物測定的新方法。方法:1.使用葉酸及相關(guān)代謝產(chǎn)物的標(biāo)準(zhǔn)品研究和建立各標(biāo)準(zhǔn)品的uplc-ms/ms分析條件及參數(shù)。比較三種不同的親水色譜柱對葉酸及相關(guān)代謝產(chǎn)物的分離效果;分別研究不同色譜條件(流動相、洗脫模式、流速、柱溫)和質(zhì)譜條件(離子源、正負(fù)離子模式、檢測模式、離子源溫度、離子噴射電壓、碰撞氣體及霧化氣體流量)下葉酸和相關(guān)代謝產(chǎn)物分離效果。2.使用正常人血清研究樣品處理的條件,使用不同的有機(jī)溶劑(甲醇、乙腈、乙酸乙酯)對樣品中蛋白質(zhì)進(jìn)行沉淀,觀察沉淀蛋白效果;觀察不同濃度的抗氧化劑組合對樣品中葉酸及相關(guān)代謝產(chǎn)物的保護(hù)作用。使用不同濃度的血清標(biāo)準(zhǔn)品驗(yàn)證所建立方法的線性、檢出限和定量限、日內(nèi)和日間精密度、回收率和穩(wěn)定性。3.應(yīng)用50例正常和神經(jīng)管畸形(neuraltubedefects,ntds)大樣本樣品進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn),確立本研究uplc-ms/ms方法的測定標(biāo)準(zhǔn)和條件參數(shù),并在動物組織中進(jìn)行試驗(yàn),研究本方法應(yīng)用的廣泛性。結(jié)果:1.標(biāo)準(zhǔn)品實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:1:9的乙腈/水可作為樣品的工作液,流動相:a為0.1%甲酸,b為乙腈。梯度洗脫,梯度洗脫的程序設(shè)定為:0~1min,99.9%a~99.9%a;1~3min,99.9%a~82%a;3~4min,82%a~10%a;4~5min,10%a~10%a;5~6min,10%a~99.9%a。平衡時間設(shè)定為1min,總分析時間為7min。流速:0.4ml/min,柱溫:40℃,進(jìn)樣量:5μl,電噴霧電離子源,正離子(esi+)模式,多反應(yīng)監(jiān)測模式,毛細(xì)管電壓:3.0kv,離子源溫度:150℃,去溶劑氣的溫度:400℃;碰撞氣流量:0.13ml/min;錐孔氣流量:30l/h,脫溶劑氣流量:900l/h。在以上實(shí)驗(yàn)條件下,葉酸及相關(guān)代謝產(chǎn)物分離效果優(yōu)良,靈敏度可達(dá)99.9%。色譜柱研究比較結(jié)果發(fā)現(xiàn)美國waters公司生產(chǎn)的acquityuplcbehc18柱(2.1mm×50mm,1.7μm)對樣品的分離效果最好。2.使用標(biāo)準(zhǔn)品加血清實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:樣品用甲醇沉淀處理效果最佳,用100μg/mL抗壞血酸,100μg/mL檸檬酸和15 mg/mL DTT(二硫蘇糖醇)組成的抗氧化體系可有效保持葉酸和相關(guān)代謝產(chǎn)物的穩(wěn)定性。3.在上述優(yōu)化的色譜和質(zhì)譜條件下,血清中六種化合物的保留時間均在3 min內(nèi),峰性良好,并且無雜峰的干擾,基線平穩(wěn)。六種化合物葉酸、5-MeTHF、5-FoTHF、Hcy、SAM和SAH的線性范圍分別是10~500 ng/mL,2~100 ng/mL,0.5~50ng/mL,50~2000 ng/mL,4~200 ng/mL,4~200 ng/mL,相關(guān)系數(shù)R2≥0.998,對應(yīng)的檢出限和定量限分別為0.05和0.20 ng/mL、0.05和0.15 ng/mL、0.05和0.20 ng/mL、0.05和0.50 ng/mL、0.20和0.50 ng/mL、0.10和0.20 ng/mL,日內(nèi)和日間精密度良好相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation,RSD)均小于5.84%,加標(biāo)回收率為90.1%-105.3%,穩(wěn)定性良好(RSD≤2.60%)。4.檢測正常組和NTDs組孕產(chǎn)婦血清中葉酸及其代謝相關(guān)的六種化合物含量對比,結(jié)果發(fā)現(xiàn),與正常對照組相比,NTDs組血清樣品中葉酸和SAM含量無明顯變化(P0.05),5-MeTHF和5-Fo THF含量均有明顯降低(P0.05),Hcy以及SAH濃度明顯升高(P0.05),同時甲基化指數(shù)(SAM:SAH)降低。對正常對照組和NTDs組胚胎腦組織中葉酸及相關(guān)代謝產(chǎn)物含量進(jìn)行檢測,結(jié)果發(fā)現(xiàn),與正常對照組相比,NTDs組胚胎腦組織樣品中葉酸、5-MeTHF、5-Fo THF、SAM含量降低(P0.05),Hcy、SAH濃度升高(P0.05)。結(jié)論:本研究首次成功建立了測定血清樣品中葉酸、5-MeTHF、5-Fo THF、Hcy、SAM、SAH六種化合物含量的高效的UPLC-MS/MS方法,并對此方法進(jìn)行了NTDs孕婦血清及動物組織的驗(yàn)證。該方法具有樣品量少(5 uL)、耗時短(7 min),成本低,靈敏度高、適用范圍廣等特點(diǎn),可用于科研及臨床大樣本的檢測。
【關(guān)鍵詞】：葉酸 超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜 血清葉酸檢測 神經(jīng)管畸形
【學(xué)位授予單位】：山西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R446.1;O657.72
【目錄】：

• 中文摘要6-9
• 英文摘要9-13
• 常用縮寫詞中英文對照表13-14
• 前言14-18
• 1 材料18-21
• 1.1 主要實(shí)驗(yàn)儀器18
• 1.2 主要試劑和樣本18-19
• 1.3 主要溶液配制19-21
• 2 方法21-27
• 2.1 方法的建立21-22
• 2.2 樣品的預(yù)處理22-23
• 2.3 方法的驗(yàn)證23-25
• 2.4 方法的應(yīng)用25-26
• 2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析26-27
• 3 結(jié)果27-47
• 3.1 方法的建立27-34
• 3.2 樣品的預(yù)處理34-42
• 3.3 方法的驗(yàn)證42-45
• 3.4 方法的應(yīng)用45-47
• 4 討論47-53
• 4.1 方法建立的必要性47-48
• 4.2 方法建立過程中的優(yōu)化48-50
• 4.3 方法建立在NTDs的應(yīng)用50-53
• 5 總結(jié)53-55
• 6 展望55-56
• 參考文獻(xiàn)56-62
• 綜述62-72
• 參考文獻(xiàn)68-72
• 致謝72-73
• 在學(xué)期間承擔(dān)/參與的科研課題與研究成果73-74
• 個人簡歷74

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1 侯一斌;尼克剎米及其代謝產(chǎn)物的氣相色譜/質(zhì)譜法檢測[J];質(zhì)譜學(xué)報(bào);1992年01期

2 殷芬,于鳴,陳楚良;反相高效液相色譜測定對硝基甲苯及其代謝產(chǎn)物[J];色譜;1988年06期

3 王軍;閆立昆;李宏鐸;萬一;;一株黏細(xì)菌Archangium gephyra的鑒定及其代謝產(chǎn)物抑菌活性的研究[J];西北大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版);2013年03期

4 謝福明;高效液相色譜在生物醫(yī)藥研究中的應(yīng)用——第八講 高效液相色譜法分析體內(nèi)藥物及代謝產(chǎn)物[J];色譜;1992年04期

5 朱峰;林永成;王軍;周世寧;Vrijmoed L LP;;一株Stysanus like sp.屬南海紅樹內(nèi)生真菌代謝產(chǎn)物的研究[J];化學(xué)研究與應(yīng)用;2005年06期

6 全文熠,趙振華,李清如;苯并(a)芘代謝產(chǎn)物的HPLC分析[J];分析測試通報(bào);1988年01期

7 肖潤梅;孫敬智;黃兆慧;馮加武;陳勇;;高效液相色譜法測定尿中甲苯代謝產(chǎn)物的實(shí)驗(yàn)研究[J];中國工業(yè)醫(yī)學(xué)雜志;2014年03期

8 吳銀良;皇甫偉國;楊挺;;超高效液相色譜法測定雞組織中二硝托胺及其代謝產(chǎn)物殘留量[J];分析化學(xué);2011年12期

9 徐燁;張春妮;曹軼男;徐梵姝;王乃芝;;HPLC法同時測定尿樣中芳香族化合物的6種代謝產(chǎn)物[J];分析測試學(xué)報(bào);2011年09期

10 陳平;;紅曲代謝產(chǎn)物的研究現(xiàn)狀和前景[J];廣西輕工業(yè);2009年09期

中國重要會議論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 鐘大放;;幾種藥物的代謝產(chǎn)物追蹤與結(jié)構(gòu)鑒定[A];第九屆全國藥物和化學(xué)異物代謝學(xué)術(shù)會議論文集[C];2009年

2 朱天驕;韋洪娟;林貞健;王發(fā)左;李德海;顧謙群;;OSMAC方法在真菌Spicaria elegans代謝產(chǎn)物研究中的應(yīng)用[A];中國化學(xué)會第八屆天然有機(jī)化學(xué)學(xué)術(shù)研討會論文集[C];2010年

3 崔美子;朱平;;豐肉結(jié)海綿相關(guān)放線菌LS-298代謝產(chǎn)物研究[A];中國菌物學(xué)會第五屆會員代表大會暨2011年學(xué)術(shù)年會論文摘要集[C];2011年

4 阮麗軍;尚新艷;戈梅;陳代杰;朱寶泉;;植物內(nèi)生真菌HCCB00189代謝產(chǎn)物研究[A];創(chuàng)新藥物及新品種研究、開發(fā)學(xué)術(shù)研討會論文集[C];2006年

5 再帕爾·阿不力孜;張瑞萍;劉健;田亞平;耿平;賀玖明;;快速發(fā)現(xiàn)與識別體內(nèi)藥物原型及其代謝產(chǎn)物的LC-MS/MS分析方法研究[A];2010年中國藥學(xué)大會暨第十屆中國藥師周論文集[C];2010年

6 王永東;李廣悅;丁德馨;胡南;;黑曲霉代謝產(chǎn)物浸鈾研究[A];中國核科學(xué)技術(shù)進(jìn)展報(bào)告（第二卷）——中國核學(xué)會2011年學(xué)術(shù)年會論文集第2冊（鈾礦冶分卷、核能動力分卷（上））[C];2011年

7 胡嘯明;柳國斌;楊曉;;臁瘡發(fā)病與代謝產(chǎn)物堆積關(guān)系的臨床研究[A];第十五次全國中西醫(yī)結(jié)合瘍科學(xué)術(shù)交流會論文匯編[C];2011年

8 陸榕;林艷萍;司端運(yùn);劉昌孝;;SR4233在大鼠體內(nèi)的代謝產(chǎn)物研究[A];第八次全國藥物與化學(xué)異物代謝學(xué)術(shù)會議論文摘要[C];2006年

9 朱峰;林永成;;產(chǎn)自兩株南海紅樹內(nèi)生真菌的代謝產(chǎn)物[A];中國海洋學(xué)會2005年學(xué)術(shù)年會論文匯編[C];2005年

10 張道海;王未名;陸文華;;營養(yǎng)條件對塊狀耳霉突變株代謝產(chǎn)物形成的影響[A];《中國蟲生真菌研究與應(yīng)用》（第四卷）[C];1996年

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1 胡喜盈;“王海”與“昂立”對簿公堂[N];醫(yī)藥經(jīng)濟(jì)報(bào);2003年

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1 王洪媛;抗UV-B輻射菌Pantoea agglomerans KFS-9的選育及其抗輻射機(jī)制的研究[D];中國海洋大學(xué);2006年

2 李藝;小檗堿的生物代謝反應(yīng)及代謝產(chǎn)物活性的研究[D];北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院;2010年

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1 邵明偉;兩種蜻蜓腸道菌的分離鑒定及其代謝產(chǎn)物研究[D];浙江師范大學(xué);2015年

2 張?zhí)N;三株昆蟲腸道共生菌的活性代謝產(chǎn)物研究[D];浙江師范大學(xué);2015年

3 董蓉;食源性致病沙門氏菌特征性代謝產(chǎn)物研究[D];廣東工業(yè)大學(xué);2016年

4 丁曉琛;血清葉酸及其相關(guān)代謝產(chǎn)物超高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法建立及應(yīng)用研究[D];山西醫(yī)科大學(xué);2016年

5 金瀅;質(zhì)譜樹狀圖相似度過濾技術(shù)進(jìn)行淫羊藿單體和藥材代謝產(chǎn)物發(fā)現(xiàn)和鑒定新策略的研究和應(yīng)用[D];北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院;2013年

6 周榮麗;海洋厭氧細(xì)菌SRB-22菌株代謝產(chǎn)物研究[D];大連交通大學(xué);2008年

7 劉慧;水稻呼吸相關(guān)代謝產(chǎn)物的親水作用色譜—串聯(lián)質(zhì)譜測定方法研究[D];中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2011年

8 馮蕾;生物樣品中酪氨酸及其代謝產(chǎn)物分析新技術(shù)研究及其應(yīng)用[D];南昌大學(xué);2012年

9 張春妮;HPLC法測定尿樣中芳香族化合物的六種代謝產(chǎn)物的研究[D];東北大學(xué);2010年

10 葉芳;南海紅樹內(nèi)生真菌#1403代謝產(chǎn)物1403-B抗腫瘤研究[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2012年

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本文編號：1082448