本文關鍵詞：基于多適配體和熒光共振能量轉移技術的蛋白質(zhì)檢測方法研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：熒光共振能量轉移(FRET)是距離足夠近的兩個熒光分子間產(chǎn)生的一種能量轉移現(xiàn)象。當供體熒光分子的發(fā)射光譜與受體熒光分子的吸收光譜重疊,并且兩個分子的距離在10nm范圍之間時,就會發(fā)生一種無輻射途徑的能量轉移。同時供體分子熒光分子淬滅,受體熒光增強的現(xiàn)象。近幾年,人們致力于這種新型技術的實踐,廣泛將其應用在生物傳感器、生物分子檢測、生物醫(yī)藥領域。氧化石墨烯(GO)一般作為能量受體可以高效地猝滅多種量子點(QDs)、有機染料的熒光。由于GO具有優(yōu)異的電學性能,而被廣泛應用到基于FRET原理的生物傳感器中。值得關注的是,目前大多數(shù)基于GO的熒光共振能量轉移的傳感器均采用單一適配體進行目標蛋白的檢測,基于目標物的多適配體GO-FRET技術實現(xiàn)目標檢測尚未見報道。微流控芯片電泳具有上樣量少,進樣方式智能化,分離時間更短等優(yōu)點。其中的二維分離系統(tǒng)比一維分離具有更高的峰容量,具有更大的研究潛力,而且芯片上的復雜微流路更容易實現(xiàn)二維或多維分離。因此,本論文基于FRET現(xiàn)象,采用多適配體構建了FRET傳感器,并且結合微流控芯片電泳技術的高效分離能力進行了高靈敏度多目標檢測研究。主要研究工作如下:(1)設計了一種基于氧化石墨烯-熒光共振能量轉移的傳感器。利用熒光基團標記的核酸多適配體作為熒光供體分子,氧化石墨烯(GO)作為熒光受體分子,首先熒光標記多適配體被氧化石墨烯吸附,適配體所標記熒光淬滅,當體系中加入的樣品中含有多適配體的配體蛋白時,蛋白會與多適配體結合并誘導這條寡核苷酸發(fā)生構象變化,從而從GO上脫落,引起熒光的重新恢復。本論文通過對核酸多適配體濃度、GO濃度的優(yōu)化,得到了GO-FRET傳感器的適宜實驗條件。比較適配體和多適配體的檢出限,初步顯示多適配體技術可以顯著提高檢測檢出靈敏度。(2)建立氧化石墨烯-多適配體FRET傳感器的方法實現(xiàn)了實際樣品大鼠尿樣中的溶菌酶的濃度測定。首先考察了在尿樣中添加不同濃度溶菌酶,考察熒光恢復程度與溶菌酶濃度的線性關系,之后測定樣品中溶菌酶濃度。實驗表明該方法可以應用于實際樣品中溶菌酶的測定。(3)將基于適配體的氧化石墨烯的FRET傳感器技術應用于凋亡細胞釋放細胞色素C的動態(tài)檢測。采用了人神經(jīng)母細胞瘤細胞,建立凋亡模型,以考察細胞凋亡過程中胞漿Cyt C變化情況。利用氧化石墨烯作為能量受體,含有熒光標記的核酸適配體作為供體研究細胞凋亡時線粒體對胞漿細胞色素C的動力學釋放,并與經(jīng)典的western blot方法進行比較。同時考察方法最低檢出限以及定量回收率。(4)設計并建立了一種基于氧化石墨烯-多適配體熒光共振能量轉移的微流控芯片電泳分離方法,實現(xiàn)了凝血酶、細胞色素C和溶菌酶三種蛋白質(zhì)的高靈敏度并且同時檢測。利用GO-多適配體的FRET現(xiàn)象使蛋白熒光恢復之后,采用第一維等點聚焦的微流控芯片電泳分離三種蛋白與各自適配體的復合物,實現(xiàn)三種目標蛋白質(zhì)的同時檢測。
【關鍵詞】：熒光共振能量轉移 核酸適配體 蛋白質(zhì)檢測 微流控芯片電泳
【學位授予單位】：北京理工大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：O657.3;R446;TP212.3
【目錄】：

• 摘要5-7
• Abstract7-12
• 第一章 緒論12-21
• 1.1 熒光共振能量轉移技術12
• 1.2 氧化石墨烯簡要介紹12-15
• 1.3 基于石墨烯的熒光共振能量轉移應用15-18
• 1.4 多適配體技術18-19
• 1.5 微流控芯片19-20
• 1.6 本論文的主要研究內(nèi)容及意義20-21
• 第二章 基于氧化石墨烯-熒光共振能量轉移的傳感器的設計21-32
• 2.1 實驗部分21-22
• 2.1.1 實驗儀器與試劑21
• 2.1.2 試劑的配制21-22
• 2.1.3 目標蛋白的檢測22
• 2.2 結果與討論22-32
• 2.2.1 最大適配體濃度的確定22-23
• 2.2.2 最大石墨烯濃度的考察23-24
• 2.2.3 不同數(shù)量適配體最大適配體濃度的比較24-25
• 2.2.4 單適配體和多適配體恢復情況比較25-28
• 2.2.5 不同蛋白濃度對熒光恢復的影響28-32
• 第三章 建立氧化石墨烯-多適配體 FRET 傳感器的方法實現(xiàn)了實際樣品大鼠尿樣中的溶菌酶的濃度測定32-35
• 3.1 引言32-33
• 3.2 實驗部分33
• 3.2.1 實驗儀器與試劑33
• 3.2.2 尿樣中溶菌酶的檢測33
• 3.3 結果與討論33-35
• 3.3.1 尿樣中溶菌酶的檢測33-35
• 第四章 基于適配體的氧化石墨烯的 FRET 傳感器技術應用于凋亡細胞釋放細胞色素 C 的動態(tài)檢測35-46
• 4.1 引言35-37
• 4.2 實驗部分37-42
• 4.2.1 實驗儀器與試劑37-39
• 4.2.2 試劑的配制39-40
• 4.2.3 SH-SY5Y人神經(jīng)母細胞瘤細胞的培養(yǎng)40
• 4.2.4 確定給藥濃度：MTT40-41
• 4.2.5 提取不含線粒體的胞漿蛋白41
• 4.2.6 目標蛋白對熒光的淬滅和恢復41
• 4.2.7 考馬斯亮藍法測定蛋白濃度41-42
• 4.3 結果與討論42-46
• 4.3.1 細胞凋亡給藥濃度確定42-43
• 4.3.2 樣品稀釋倍數(shù)的確定43
• 4.3.3 樣品稀釋倍數(shù)的確定43-44
• 4.3.4 對不同給要濃度作用對凋亡細胞所釋放對CYT C的檢測44
• 4.3.5 與經(jīng)典實驗WESTERN BLOT的對比44-46
• 第五章 建立GO-多適配體FRET傳感器的微流控芯片電泳分離蛋白46-52
• 5.1 實驗部分46-50
• 5.1.0 實驗儀器與試劑46
• 5.1.1 實驗試劑46-47
• 5.1.2 芯片制作流程47-48
• 5.1.3 溶液配制48
• 5.1.4 芯片刻蝕流程48
• 5.1.5 芯片熱鍵和48-49
• 5.1.6 雙T通道結構49-50
• 5.1.7 蛋白等電聚焦分離50
• 5.2 結果與討論50-52
• 5.2.1 芯片電泳結果50-52
• 結論52-53
• 參考文獻53-58
• 攻讀學位期間發(fā)表論文與研究成果清單58-59
• 致謝59

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