本文關(guān)鍵詞：基于多適配體和熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)的蛋白質(zhì)檢測方法研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)是距離足夠近的兩個(gè)熒光分子間產(chǎn)生的一種能量轉(zhuǎn)移現(xiàn)象。當(dāng)供體熒光分子的發(fā)射光譜與受體熒光分子的吸收光譜重疊,并且兩個(gè)分子的距離在10nm范圍之間時(shí),就會(huì)發(fā)生一種無輻射途徑的能量轉(zhuǎn)移。同時(shí)供體分子熒光分子淬滅,受體熒光增強(qiáng)的現(xiàn)象。近幾年,人們致力于這種新型技術(shù)的實(shí)踐,廣泛將其應(yīng)用在生物傳感器、生物分子檢測、生物醫(yī)藥領(lǐng)域。氧化石墨烯(GO)一般作為能量受體可以高效地猝滅多種量子點(diǎn)(QDs)、有機(jī)染料的熒光。由于GO具有優(yōu)異的電學(xué)性能,而被廣泛應(yīng)用到基于FRET原理的生物傳感器中。值得關(guān)注的是,目前大多數(shù)基于GO的熒光共振能量轉(zhuǎn)移的傳感器均采用單一適配體進(jìn)行目標(biāo)蛋白的檢測,基于目標(biāo)物的多適配體GO-FRET技術(shù)實(shí)現(xiàn)目標(biāo)檢測尚未見報(bào)道。微流控芯片電泳具有上樣量少,進(jìn)樣方式智能化,分離時(shí)間更短等優(yōu)點(diǎn)。其中的二維分離系統(tǒng)比一維分離具有更高的峰容量,具有更大的研究潛力,而且芯片上的復(fù)雜微流路更容易實(shí)現(xiàn)二維或多維分離。因此,本論文基于FRET現(xiàn)象,采用多適配體構(gòu)建了FRET傳感器,并且結(jié)合微流控芯片電泳技術(shù)的高效分離能力進(jìn)行了高靈敏度多目標(biāo)檢測研究。主要研究工作如下:(1)設(shè)計(jì)了一種基于氧化石墨烯-熒光共振能量轉(zhuǎn)移的傳感器。利用熒光基團(tuán)標(biāo)記的核酸多適配體作為熒光供體分子,氧化石墨烯(GO)作為熒光受體分子,首先熒光標(biāo)記多適配體被氧化石墨烯吸附,適配體所標(biāo)記熒光淬滅,當(dāng)體系中加入的樣品中含有多適配體的配體蛋白時(shí),蛋白會(huì)與多適配體結(jié)合并誘導(dǎo)這條寡核苷酸發(fā)生構(gòu)象變化,從而從GO上脫落,引起熒光的重新恢復(fù)。本論文通過對核酸多適配體濃度、GO濃度的優(yōu)化,得到了GO-FRET傳感器的適宜實(shí)驗(yàn)條件。比較適配體和多適配體的檢出限,初步顯示多適配體技術(shù)可以顯著提高檢測檢出靈敏度。(2)建立氧化石墨烯-多適配體FRET傳感器的方法實(shí)現(xiàn)了實(shí)際樣品大鼠尿樣中的溶菌酶的濃度測定。首先考察了在尿樣中添加不同濃度溶菌酶,考察熒光恢復(fù)程度與溶菌酶濃度的線性關(guān)系,之后測定樣品中溶菌酶濃度。實(shí)驗(yàn)表明該方法可以應(yīng)用于實(shí)際樣品中溶菌酶的測定。(3)將基于適配體的氧化石墨烯的FRET傳感器技術(shù)應(yīng)用于凋亡細(xì)胞釋放細(xì)胞色素C的動(dòng)態(tài)檢測。采用了人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞,建立凋亡模型,以考察細(xì)胞凋亡過程中胞漿Cyt C變化情況。利用氧化石墨烯作為能量受體,含有熒光標(biāo)記的核酸適配體作為供體研究細(xì)胞凋亡時(shí)線粒體對胞漿細(xì)胞色素C的動(dòng)力學(xué)釋放,并與經(jīng)典的western blot方法進(jìn)行比較。同時(shí)考察方法最低檢出限以及定量回收率。(4)設(shè)計(jì)并建立了一種基于氧化石墨烯-多適配體熒光共振能量轉(zhuǎn)移的微流控芯片電泳分離方法,實(shí)現(xiàn)了凝血酶、細(xì)胞色素C和溶菌酶三種蛋白質(zhì)的高靈敏度并且同時(shí)檢測。利用GO-多適配體的FRET現(xiàn)象使蛋白熒光恢復(fù)之后,采用第一維等點(diǎn)聚焦的微流控芯片電泳分離三種蛋白與各自適配體的復(fù)合物,實(shí)現(xiàn)三種目標(biāo)蛋白質(zhì)的同時(shí)檢測。
【關(guān)鍵詞】：熒光共振能量轉(zhuǎn)移 核酸適配體 蛋白質(zhì)檢測 微流控芯片電泳
【學(xué)位授予單位】：北京理工大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：O657.3;R446;TP212.3
【目錄】：

• 摘要5-7
• Abstract7-12
• 第一章 緒論12-21
• 1.1 熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)12
• 1.2 氧化石墨烯簡要介紹12-15
• 1.3 基于石墨烯的熒光共振能量轉(zhuǎn)移應(yīng)用15-18
• 1.4 多適配體技術(shù)18-19
• 1.5 微流控芯片19-20
• 1.6 本論文的主要研究內(nèi)容及意義20-21
• 第二章 基于氧化石墨烯-熒光共振能量轉(zhuǎn)移的傳感器的設(shè)計(jì)21-32
• 2.1 實(shí)驗(yàn)部分21-22
• 2.1.1 實(shí)驗(yàn)儀器與試劑21
• 2.1.2 試劑的配制21-22
• 2.1.3 目標(biāo)蛋白的檢測22
• 2.2 結(jié)果與討論22-32
• 2.2.1 最大適配體濃度的確定22-23
• 2.2.2 最大石墨烯濃度的考察23-24
• 2.2.3 不同數(shù)量適配體最大適配體濃度的比較24-25
• 2.2.4 單適配體和多適配體恢復(fù)情況比較25-28
• 2.2.5 不同蛋白濃度對熒光恢復(fù)的影響28-32
• 第三章 建立氧化石墨烯-多適配體 FRET 傳感器的方法實(shí)現(xiàn)了實(shí)際樣品大鼠尿樣中的溶菌酶的濃度測定32-35
• 3.1 引言32-33
• 3.2 實(shí)驗(yàn)部分33
• 3.2.1 實(shí)驗(yàn)儀器與試劑33
• 3.2.2 尿樣中溶菌酶的檢測33
• 3.3 結(jié)果與討論33-35
• 3.3.1 尿樣中溶菌酶的檢測33-35
• 第四章 基于適配體的氧化石墨烯的 FRET 傳感器技術(shù)應(yīng)用于凋亡細(xì)胞釋放細(xì)胞色素 C 的動(dòng)態(tài)檢測35-46
• 4.1 引言35-37
• 4.2 實(shí)驗(yàn)部分37-42
• 4.2.1 實(shí)驗(yàn)儀器與試劑37-39
• 4.2.2 試劑的配制39-40
• 4.2.3 SH-SY5Y人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的培養(yǎng)40
• 4.2.4 確定給藥濃度：MTT40-41
• 4.2.5 提取不含線粒體的胞漿蛋白41
• 4.2.6 目標(biāo)蛋白對熒光的淬滅和恢復(fù)41
• 4.2.7 考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白濃度41-42
• 4.3 結(jié)果與討論42-46
• 4.3.1 細(xì)胞凋亡給藥濃度確定42-43
• 4.3.2 樣品稀釋倍數(shù)的確定43
• 4.3.3 樣品稀釋倍數(shù)的確定43-44
• 4.3.4 對不同給要濃度作用對凋亡細(xì)胞所釋放對CYT C的檢測44
• 4.3.5 與經(jīng)典實(shí)驗(yàn)WESTERN BLOT的對比44-46
• 第五章 建立GO-多適配體FRET傳感器的微流控芯片電泳分離蛋白46-52
• 5.1 實(shí)驗(yàn)部分46-50
• 5.1.0 實(shí)驗(yàn)儀器與試劑46
• 5.1.1 實(shí)驗(yàn)試劑46-47
• 5.1.2 芯片制作流程47-48
• 5.1.3 溶液配制48
• 5.1.4 芯片刻蝕流程48
• 5.1.5 芯片熱鍵和48-49
• 5.1.6 雙T通道結(jié)構(gòu)49-50
• 5.1.7 蛋白等電聚焦分離50
• 5.2 結(jié)果與討論50-52
• 5.2.1 芯片電泳結(jié)果50-52
• 結(jié)論52-53
• 參考文獻(xiàn)53-58
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表論文與研究成果清單58-59
• 致謝59

【相似文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 王巍;賈凌云;;適配體篩選方法研究進(jìn)展[J];分析化學(xué);2009年03期

2 謝海燕;陳薛釵;鄧玉林;;核酸適配體及其在化學(xué)領(lǐng)域的相關(guān)應(yīng)用[J];化學(xué)進(jìn)展;2007年06期

3 屈鋒;劉允;任肖敏;趙新穎;張經(jīng)華;;毛細(xì)管電泳在核酸適配體研究及核酸適配體篩選中的應(yīng)用[J];化學(xué)進(jìn)展;2009年Z2期

4 趙強(qiáng);樂曉春;;核酸適配體親和色譜的研究進(jìn)展[J];色譜;2009年05期

5 朱靜;黃勇;蔣小平;譚鐘揚(yáng);蔣健暉;沈國勵(lì);俞汝勤;;基于核酸適配體-質(zhì)粒DNA復(fù)合物信號(hào)放大的熒光免疫傳感技術(shù)[J];分析化學(xué);2009年11期

6 ;生物分析中的核酸適配體[J];分析化學(xué);2012年05期

7 李瑜;王源升;于斌;張靜秋;董瑞;;核酸適配體在光生化檢測中的應(yīng)用[J];廣州化工;2012年14期

8 王周平;張維瀟;;適配體及其研究進(jìn)展[J];食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào);2013年09期

9 ;《核酸適配體手冊》[J];分析化學(xué);2013年12期

10 李曉佩;楊良嶸;黃昆;李文松;孫西同;劉會(huì)洲;;核酸適配體在生化分離及檢測領(lǐng)域中的研究進(jìn)展[J];化工學(xué)報(bào);2013年01期

中國重要會(huì)議論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 蔡圣;劉彩云;盧建忠;;基于核酸適配體和酶循環(huán)放大的腺苷化學(xué)發(fā)光檢測[A];中國化學(xué)會(huì)第十屆全國發(fā)光分析學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2011年

2 陳巍;趙新穎;屈鋒;;毛細(xì)管電泳法篩選蛋白質(zhì)的核酸適配體的初步研究[A];全國生物醫(yī)藥色譜學(xué)術(shù)交流會(huì)（2010景德鎮(zhèn)）論文集[C];2010年

3 楊曉娟;邴濤;梅宏成;上官棣華;;核酸適配體用于手性拆分L型和D型色氨酸[A];全國生物醫(yī)藥色譜學(xué)術(shù)交流會(huì)（2010景德鎮(zhèn)）論文集[C];2010年

4 鄭冬梅;婁新徽;;一種基于結(jié)構(gòu)開關(guān)型適配體的無標(biāo)記熒光傳感法[A];中國化學(xué)會(huì)第28屆學(xué)術(shù)年會(huì)第9分會(huì)場摘要集[C];2012年

5 薛利云;周小明;邢達(dá);;基于核酸適配體探針和酶輔助熒光信號(hào)擴(kuò)增的等溫高靈敏度蛋白檢測方法[A];中國光學(xué)學(xué)會(huì)2011年學(xué)術(shù)大會(huì)摘要集[C];2011年

6 馬文韜;古力;屈鋒;;毛細(xì)管電泳篩選大腸桿菌適配體的初步研究[A];全國生物醫(yī)藥色譜學(xué)術(shù)交流會(huì)（2010景德鎮(zhèn)）論文集[C];2010年

7 梁好均;徐華國;鄧偉;;核酸適配體鏈構(gòu)象轉(zhuǎn)變的研究[A];2014年兩岸三地高分子液晶態(tài)與超分子有序結(jié)構(gòu)學(xué)術(shù)研討會(huì)摘要集[C];2014年

8 王曉芳;程琳;耿霞;趙強(qiáng);;基于適配體修飾的磁珠和量子點(diǎn)熒光法檢測凝血酶[A];中國化學(xué)會(huì)第28屆學(xué)術(shù)年會(huì)第9分會(huì)場摘要集[C];2012年

9 汪海林;章大鵬;;單核苷水平核酸適配體與蛋白質(zhì)相互作用分析[A];中國化學(xué)會(huì)第28屆學(xué)術(shù)年會(huì)第9分會(huì)場摘要集[C];2012年

10 溫桂清;范燕燕;梁愛惠;蔣治良;;核酸適配體納米金共振散射光譜檢測血清中鉀離子[A];中國化學(xué)會(huì)第十五屆全國有機(jī)分析及生物分析學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2009年

中國重要報(bào)紙全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 潘文;核酸適配體在醫(yī)藥領(lǐng)域應(yīng)用前景廣闊[N];中國醫(yī)藥報(bào);2010年

2 于洋　田野;蛋白質(zhì)檢測有了新方法[N];吉林日報(bào);2011年

中國博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 黃玉坤;基于核酸適配體識(shí)別-時(shí)間分辨熒光納米探針的生物毒素檢測方法研究[D];江南大學(xué);2015年

2 陳霞;功能核酸的篩選及在分析檢測中的應(yīng)用[D];武漢大學(xué);2012年

3 林雪霞;微流控芯片與可控適配體技術(shù)用于細(xì)胞代謝物分析及其相互作用的研究[D];北京化工大學(xué);2015年

4 周慶同;生物相空間中的適配體和藥物虛擬篩選[D];中國科學(xué)技術(shù)大學(xué);2015年

5 郭業(yè)民;基于適配體傳感器的牛奶中抗生素殘留快速檢測技術(shù)研究[D];東北農(nóng)業(yè)大學(xué);2015年

6 李菁菁;適配體功能化的熒光納米探針用于蛋白和細(xì)胞傳感研究[D];南京大學(xué);2012年

7 于鴿;乙丙肝病毒相互干擾及適配體在肝癌診斷及靶向治療中的作用[D];吉林大學(xué);2016年

8 王成全;基于磁控適配體傳感體系的農(nóng)產(chǎn)品中典型霉菌毒素檢測研究[D];江蘇大學(xué);2016年

9 嚴(yán)喜鸞;基于核酸適配體化學(xué)發(fā)光檢測新技術(shù)的研究[D];復(fù)旦大學(xué);2009年

10 胡獻(xiàn)剛;新興適配體在高效凈化/診斷環(huán)境與生物體內(nèi)污染物的特點(diǎn)及其機(jī)理[D];南開大學(xué);2012年

中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 張?jiān)聜b;蛋白質(zhì)寡核苷酸適配體的篩選與應(yīng)用研究[D];山東師范大學(xué);2009年

2 李慧玲;BHL DNA適配體對銅綠假單胞菌群體感應(yīng)系統(tǒng)抑制作用的研究[D];福建醫(yī)科大學(xué);2015年

3 劉金釧;適配體納米金比色法靈敏度影響因素研究及其在食品安全檢測中的應(yīng)用[D];中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2015年

4 于連元;核酸適配體修飾的納米顆粒在腫瘤靶向免疫治療及靶向熱療中的應(yīng)用[D];北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院;2015年

5 趙變軍;基于適配體特異性作用的乳腺癌細(xì)胞表面多種腫瘤標(biāo)記物同時(shí)檢測的新方法研究[D];南京師范大學(xué);2015年

6 喬醴峰;基于核酸適配體的β-葡萄糖醛酸苷酶一步純化固定化研究及其應(yīng)用[D];石河子大學(xué);2015年

7 呂莉;基于適配體的酶聯(lián)吸光度法檢測血小板衍生生長因子-BB[D];山西大學(xué);2015年

8 陳艷霞;核酸適配體/小檗堿熒光體系的構(gòu)筑及分析應(yīng)用[D];山西大學(xué);2015年

9 呂琴;基于熒光標(biāo)記適配體的熒光各向異性法檢測小分子[D];山西大學(xué);2015年

10 朱志玲;基于核酸適配體的赭曲霉毒素A SPR檢測技術(shù)研究[D];北京化工大學(xué);2015年

  本文關(guān)鍵詞：基于多適配體和熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)的蛋白質(zhì)檢測方法研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

，

本文編號(hào)：367746