【摘要】：近年來,研究人員不斷發(fā)展能夠早期診斷人類疾病或檢測食品、環(huán)境中有害物質(zhì)的高靈敏生物傳感技術(shù)。當(dāng)極低濃度的疾病標(biāo)志物或食品污染物存在時,單純基于受體-配體相互作用的傳統(tǒng)生物傳感方法通常不夠靈敏,難以滿足早期預(yù)警的要求。因此,核酸等溫酶擴(kuò)增技術(shù)的發(fā)展對超靈敏生物傳感器的構(gòu)建及其在現(xiàn)代生物學(xué)、生物醫(yī)學(xué)及食品安全等領(lǐng)域中的應(yīng)用具有重要意義。滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)(RCA)作為等溫酶放大技術(shù)中應(yīng)用最廣泛的一類,具有高效性及快速反應(yīng)動力學(xué)的特點(diǎn),通過信號的指數(shù)倍擴(kuò)增提高檢測靈敏度。本論文以核酸作為生物識別元件,以疾病標(biāo)志物和食品安全污染物作為檢測目標(biāo)物,將滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)及其他信號放大策略與熒光分析法相結(jié)合,構(gòu)建了三種快速、高精度、超靈敏的新型光學(xué)生物傳感器,分別用于尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)與赭曲霉毒素A(OTA)的檢測。本研究論文的主要內(nèi)容由以下三部分組成:第一,基于目標(biāo)物介導(dǎo)內(nèi)切酶輔助滾環(huán)擴(kuò)增策略,構(gòu)建了一種新型的熒光生物傳感器,用于UDG活性檢測。目標(biāo)物UDG能夠特異性移除核酸探針上的堿基U并產(chǎn)生能夠被核酸內(nèi)切酶IV特異性切割的無嘌呤無嘧啶位點(diǎn)(AP位點(diǎn)),進(jìn)而生成引物鏈用于啟動滾環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)。標(biāo)有AP位點(diǎn)的分子信標(biāo)能夠與RCA產(chǎn)物結(jié)合,使核酸內(nèi)切酶IV能夠特異性識別AP位點(diǎn)并斷裂,釋放熒光基團(tuán),從而實(shí)現(xiàn)了對UDG活性的超靈敏、高特異性檢測。該方法中多功能發(fā)夾型探針經(jīng)過特殊設(shè)計(jì),不僅可以作為核酸探針與目標(biāo)物UDG特異性識別,而且可通過堿基切除修復(fù)通路產(chǎn)生大量的RCA引物,啟動了聚合-剪切的循環(huán)放大反應(yīng)。在最優(yōu)的實(shí)驗(yàn)條件下,該熒光傳感器的最低檢測限為9.3×10~(-5)U mL~(-1),檢測范圍達(dá)5個數(shù)量級,實(shí)現(xiàn)了UDG活性的超靈敏檢測。同時,該方法能夠有效避免非特異性熒光信號的產(chǎn)生。另外,通過重新設(shè)計(jì)核酸探針的序列,該方法還可用于其他目標(biāo)糖基化酶的超靈敏、高精度檢測。第二,以UDG作為模式分析物,構(gòu)建了一種基于修復(fù)酶輔助引物重塑擴(kuò)增的快速指數(shù)倍擴(kuò)增策略。將環(huán)狀模板(CT)分別與含有尿嘧啶的發(fā)夾探針(UHP)及嵌入AP位點(diǎn)的雙標(biāo)記熒光探針(AFP)雜交制備出復(fù)合探針I(yè)和復(fù)合探針I(yè)I。目標(biāo)物UDG與復(fù)合探針I(yè)特異性結(jié)合,產(chǎn)生AP位點(diǎn),隨后通過核酸內(nèi)切酶IV進(jìn)行切割,并通過phi29 DNA聚合酶對不匹配的3’端進(jìn)行重塑,從而產(chǎn)生啟動初級RCA的可用引物-CT復(fù)合物。復(fù)合探針I(yè)I可與初級RCA產(chǎn)物雜交,使AP位點(diǎn)嵌入到雙鏈結(jié)構(gòu)中。在Endo IV和phi29DNA聚合酶的作用下,AFP作為復(fù)合探針I(yè)I的預(yù)引物轉(zhuǎn)化為成熟引物,啟動多級RCA反應(yīng)。并且,大量的AFP被裂解,釋放出很強(qiáng)的熒光信號。該傳感器的檢測限與方案一相比,提高至4.7×10~(-5) U mL~(-1)。因此,該策略可為臨床診斷和基礎(chǔ)生物醫(yī)學(xué)研究中痕量分析物的檢測提供技術(shù)支持。第三,基于目標(biāo)物介導(dǎo)的引物重塑RCA激活多位點(diǎn)CHA策略并同時形成Y型DNA探針(Y-DNTs),構(gòu)建了一種無標(biāo)記熒光生物傳感器,用于OTA的超靈敏檢測。適配體結(jié)構(gòu)切換可以通過簡單的設(shè)計(jì)來實(shí)現(xiàn),即環(huán)狀模板、OTA適配體(S1)及RCA的預(yù)引物S2結(jié)合形成復(fù)合探針I(yè)。因此,OTA與適配體特異性結(jié)合,啟動phi29 DNA聚合酶催化的引物重塑過程,該過程具有高效性、高選擇性。RCA產(chǎn)物作為CHA的啟動單元,可與大量巧妙設(shè)計(jì)的復(fù)合探針I(yè)I結(jié)合成雙鏈,實(shí)現(xiàn)并發(fā)的雙重?cái)U(kuò)增反應(yīng)。通過CHA過程可生成Y-DNTs,使兩個分裂的G-四聯(lián)體片段足夠靠近,形成完整的G-四聯(lián)體結(jié)構(gòu),并作為信號傳導(dǎo)單元增強(qiáng)NMM的熒光信號輸出。該方法檢測限可達(dá)0.2×10~(-3) ng mL~(-1),檢測范圍包括4個數(shù)量級。該傳感器能夠準(zhǔn)確靈敏地檢測OTA,并能對實(shí)際樣品進(jìn)行分析。
【圖文】：

碼、調(diào)控和表達(dá)中發(fā)揮著多種重要作用。因此，核酸常要標(biāo)志物。核酸除了具有生物學(xué)功能外，，還可作為離子的高親和力識別分子[40-42]。核酸也可以與有機(jī)或無機(jī)材[43, 44]。DNA 擴(kuò)增技術(shù)依據(jù)反應(yīng)條件可以分為非等溫?cái)U(kuò)擴(kuò)增技術(shù)（如滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)、催化發(fā)夾自組裝反應(yīng)等）術(shù)反應(yīng)（Polymerase Chain Reaction，PCR）是最早應(yīng)用的是當(dāng)今實(shí)用的擴(kuò)增技術(shù)，可用于目的核酸的擴(kuò)增和痕量多個領(lǐng)域廣泛應(yīng)用，但其技術(shù)常需要熱循環(huán)設(shè)備作為支CR 技術(shù)在資源有限的環(huán)境中和在即時檢測中的應(yīng)用[46]

交的短 DNA 鏈（引物鏈），這一過程被稱為滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)[49, 50]。如圖 1的 RCA 過程中，DNA 聚合酶會進(jìn)行基于環(huán)狀模板的滾動實(shí)現(xiàn)數(shù)百次至大。因此，RCA 產(chǎn)物是與環(huán)狀 DNA 模板互補(bǔ)并帶有重復(fù)序列的非常子（長度大約是數(shù)百個納米至微米）[51]。在此之后，RCA 作為一種新技術(shù)引起了廣泛關(guān)注，并被認(rèn)為是診斷基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)中用于超蛋白質(zhì)的重要技術(shù)手段[52-54]。特別是，基于掛鎖探針的 RCA 技術(shù)已廣析[55, 56]。該方法利用線性掛鎖探針，兩端通過與目標(biāo) DNA（或 RNA雜交并置。掛鎖探針的兩端由 DNA 連接酶鏈接，所得到的 DNA 環(huán)在合適（如 phi29 DNA 聚合酶等）和脫氧核苷三磷酸（dNTPs）的作用下可進(jìn)CA 產(chǎn)物與熒光基團(tuán)標(biāo)記的互補(bǔ) DNA 探針雜交，可通過共聚焦顯微鏡A 過程可以通過分子信標(biāo)、熒光探針或熒光染料實(shí)現(xiàn)實(shí)時監(jiān)控。
【學(xué)位授予單位】：濟(jì)南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：TP212.3

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