【摘要】：睡眠問題影響著現(xiàn)代人的健康,透支著人們的身體,成為許多疾病的誘因,以及成為高血壓、糖尿病以及青少年智力發(fā)育的重要影響因素,因此解決當(dāng)代人的睡眠問題是解決許多其他疾病的關(guān)鍵所在,解決睡眠問題迫在眉睫�，F(xiàn)在臨床上使用的安眠類藥物一般是安眠類西藥,如地西泮、巴氯芬等。但是此類藥物只能在短期內(nèi)解決睡眠,長(zhǎng)期用藥會(huì)造成耐藥性和誘發(fā)其他不良反應(yīng),因此尋找安全有效的替代類藥品解決問題的根源所在。酸棗仁是一種具有安眠鎮(zhèn)靜作用的傳統(tǒng)中藥,在著名古籍《本草綱目》和《神農(nóng)本草經(jīng)》中都早有記載�，F(xiàn)代研究表明:酸棗仁皂苷A和酸棗仁皂苷B是酸棗仁中主要起作用的物質(zhì),其中以酸棗仁皂苷A含量最多,也是安眠鎮(zhèn)靜的主要活性成分。電化學(xué)生物傳感器是一種利用電化學(xué)作為換能器,利用生物活性元件作為敏感元件的精致測(cè)量?jī)x器�；诖�,本研究利用兩種不同的生物學(xué)元件——GABA_BR1a受體和大鼠的小腸組織制作兩種不同電化學(xué)生物傳感器,均對(duì)酸棗仁皂苷A與其受體GABA_BR1a的作用進(jìn)行檢測(cè)。取成年SD大鼠小腸組織,清洗干凈并將整段的小腸進(jìn)行分段,取空腸段中間的一小段,然后將其制成面積約為0.25 cm~2的單層膜,使用淀粉-海藻酸鈉為固定劑,將該測(cè)定膜固定在兩張核微孔膜,最后在固定在中間玻碳電極表面制成“三明治”結(jié)構(gòu)的測(cè)定膜,此為本研究所使用的生物敏感元件。該組裝過程每一步都使用循環(huán)伏安法進(jìn)行表征。然后利用電化學(xué)工作站,將組裝好的電極用時(shí)間電流法對(duì)不同濃度的酸棗仁皂苷A溶液進(jìn)行定量化檢測(cè)。結(jié)果表明在一定濃度范圍內(nèi)小腸組織與酸棗仁皂苷A呈現(xiàn)雙曲線,使用雙曲線模型進(jìn)行回歸擬合,相關(guān)系數(shù)(R~2)為0.98615;經(jīng)過分析,使用雙倒數(shù)法(Lineweaver-Burk方程)作圖并進(jìn)行回歸分析,R~2為0.99002,并進(jìn)一步計(jì)算得出受體-配基相互作用激活常數(shù)為5.0035×10~(-16)mol/L。通過與裸電極相比,進(jìn)一步推導(dǎo)分析計(jì)算得出信號(hào)放大倍數(shù)為108倍,以及計(jì)算得出小腸細(xì)胞上GABA受體的個(gè)數(shù)約為5個(gè)。使用該同一只傳感器對(duì)同一樣品測(cè)定10次,R.S.D為4.98%,對(duì)不同批次的該傳感器5支進(jìn)行測(cè)定,R.S.D為2.346%,說明該傳感器的重現(xiàn)性良好;電極保存在4℃的PBS上方,第3天時(shí)為最初響應(yīng)信號(hào)的89.47%,第7天時(shí)為84.79%,說明該傳感器穩(wěn)定性良好。通過NCBI查找GABA受體基因GABA_BR1a,利用真核表達(dá)載體pcDNA3.1獲得重組質(zhì)粒,使用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染至HEK-239T細(xì)胞,利用HEK-239T細(xì)胞的表達(dá)系統(tǒng)培養(yǎng)表達(dá)獲得目的蛋白,至此獲得本研究所需要的第一種生物活性物質(zhì)。然后利用自組裝等方法,在玻碳電極表面依次固定殼聚糖、納米金溶膠、GABA_BR1a蛋白溶液、硫堇-殼聚糖混合物、辣根過氧化物酶-納米金溶膠、GABA_BR1a蛋白溶液,最后用牛血清白蛋白封閉。該組裝過程每一步都使用循環(huán)伏安法進(jìn)行表征。然后使用電化學(xué)工作站,將組裝好的電極用時(shí)間-電流法對(duì)不同濃度的酸棗仁皂苷A溶液進(jìn)行定量化檢測(cè)。結(jié)果表明在一定濃度范圍內(nèi)GABA_BR1a與酸棗仁皂苷A呈現(xiàn)雙曲線,使用雙曲線模型進(jìn)行回歸擬合,相關(guān)系數(shù)(R~2)為0.97435;使用雙倒數(shù)法(Lineweaver-Burk方程)作圖并進(jìn)行回歸分析,R~2為0.96416,并進(jìn)一步計(jì)算得出受體-配基相互作用激活常數(shù)為4.758×10-15mol/L。說明該傳感器在一定程度上可以模擬體內(nèi)的信號(hào)傳遞過程,揭示了受體與配體相互作用的關(guān)系。使用該同一只傳感器對(duì)同一樣品測(cè)定10次,R.S.D為5.86%,對(duì)不同批次的該傳感器5支進(jìn)行測(cè)定,R.S.D為1.723%,說明該傳感器的重現(xiàn)性良好;電極保存在4℃的PBS上方,第3天時(shí)為最初響應(yīng)信號(hào)的92.54%,第7天時(shí)為88.79%,說明該傳感器穩(wěn)定性良好。通過上述兩種不同的電化學(xué)生物傳感器的研究,我們既在分子層面討論了酸棗仁皂苷A與GABA受體的作用關(guān)系,又在組織層面揭示了小腸組織與酸棗仁皂苷A的相互作用。這對(duì)于酸棗仁皂苷A的藥物評(píng)價(jià)以及G蛋白偶聯(lián)受體藥物的開發(fā)和篩選提供了一定的參考意義。同時(shí)該研究也提出了一種新的研究細(xì)胞信號(hào)傳遞的思路,揭示了細(xì)胞的信號(hào)放大倍數(shù)和細(xì)胞上的受體個(gè)數(shù),這種思考方式以及細(xì)胞信號(hào)放大倍數(shù)和受體個(gè)數(shù)等參數(shù)對(duì)于今后關(guān)于藥物篩選等方面的研究提供了新的思考方向。
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【學(xué)位授予單位】：天津商業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R285.5;TP212.3

【參考文獻(xiàn)】

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3 周文嬌;王利剛;李曄;高文斌;孫昕，

本文編號(hào)：2443519