【摘要】：納米技術是在小于100納米的尺度下對材料和物體進行研究的技術。八十年代初期,納德里安·西曼(Nadrian Seeman)首先提出了DNA納米技術的概念。其關鍵是核酸鏈,通過堿基配對的高特異和可預測性實現設計的可控操作。DNA納米技術分為兩個領域:結構DNA納米技術(Structural DNA nanotechnology)和動態(tài)DNA納米技術(Dynamic DNA nanotechnology)。其中后者運用一種toehold介導的鏈置換反應(Toeholdmediated strand displacement)機制使雙鏈和單鏈之間進行動態(tài)重組,形成更穩(wěn)定的新雙鏈并且釋放出一條單鏈。Toehold是一個短的單鏈區(qū)域,作為鏈置換反應的動力,其通常由5-8個堿基組成。利用鏈置換原理設計了一系列包括邏輯電路、納米機器人、鏈置換級聯(lián)反應放大器等納米設備,其強大的置換動力和可預測性使得動態(tài)DNA納米技術有望用于分子電子學以及醫(yī)療等領域。在DNA生物傳感器中,DNA被當作生物識別元件去識別靶標。在識別過程中,產生的微小變化可以通過信號轉換元件轉換成可測定的信號以及肉眼可觀察到的圖形,從而實現對待測靶標的痕量分析。常見的信號轉換元件,如電化學、熒光,石英晶體微天平和場效應晶體管等,使DNA生物傳感器得以繁榮發(fā)展。其中,電化學DNA生物傳感器因成本低廉、易微型化、靈敏度高、抗干擾能力強等優(yōu)勢,在床旁檢測、分子診斷等領域有極大的應用前景。本工作中,將動態(tài)DNA納米技術與電化學生物傳感器結合起來,圍繞著如何提高信噪比、實現傳感器的快速制備及靶標的一步檢出等關鍵問題設計一系列基于DNA結構轉換的檢測平臺。兩種基于鏈置換反應的電化學生物傳感器,一類是“信號關”(“Signal off”)模式,檢測靶標前后信號變化由高到低,另一類是“信號開”(“Signal on”)模式,即靶標檢測前后信號變化由低到高。本文開展的工作是關于基因檢測方法學的研究,具體內容如下:第一章:基于toehold設計的半雜交雙鏈探針構建“signaloff”電化學核酸傳感器在“signaloff”模式中,結構轉換類電化學dna傳感器的靈敏度不高主要是因為電極表面的氧化還原標志物無法清除,遮掩了靶標產生的信號。為了解決這個問題,設計了一種半雜交的雙鏈探針,由一條較長的巰基鏈和一條較短的信號鏈組成,類似一個帶有切口的莖環(huán)。半雜交體可以提供驅動dna鏈置換反應的toehold。當檢測靶標時,靶標與巰基鏈雜交形成新的完全互補的雙鏈體,同時信號鏈被置換下來脫離電極表面。這個反應可以從根本上消除電極表面上的信號鏈在靶標響應后殘留的背景電流,從而提高檢測的靈敏度。這個新型的基于toehold的電化學dna傳感器實現了低至0.2pm/l的檢測限,比經典莖環(huán)探針構建的電化學檢測平臺的檢測限低兩個數量級。同時,雙鏈探針中的toehold賦予鏈置換反應高的選擇性以及與靶標結合的動力。此外,該傳感器還能再生,重復使用,甚至還能在復雜的人血清中檢測低濃度的靶標,體現出良好的抗干擾能力。綜上所述,基于dna鏈置換反應構建的電化學傳感平臺具有高靈敏、高選擇性等優(yōu)點,顯示了其比傳統(tǒng)電化學dna傳感器在床旁檢測中更具有應用前景。第二章:基于dna鏈置換反應和酶催化放大技術構建的一步式高靈敏dna電化學傳感器“signaloff”模式的電化學傳感器檢測靶標時,其信號變化率不超過100%,因此設計了另一種“signalon”模式的電化學傳感器。首先,依舊是先將一條雙鏈探針固定在電極表面,與前面不同的是,探針中巰基鏈的另一端是電活性分子,而另一條鏈是沒有任何修飾的輔助鏈,只是為了提供一個toehold。當靶標存在時,該輔助鏈通過toehold與靶標雜交形成新的雙鏈體脫離電極表面被釋放到溶液中。另外,前一個設計還有一個不足之處是受1:1的響應限制,即每個靶標分子只能與一個捕獲鏈雜交導致一個鏈置換事件的發(fā)生,這樣就限制了其在實際應用中的檢測范圍。因此這里還引入了核酸外切酶Ⅲ催化的信號放大策略。由于新雙鏈體的一端是平末端,因此會被溶液中的核酸外切酶識別并且特異的從3'平末端開始切割,直到輔助鏈被完全水解,靶標被釋放參與下一個鏈置換反應。反應60分鐘后,最終電極表面固定的大部分巰基鏈在鹽離子的作用下回到其最原始的莖環(huán)結構,同時電活性分子被拉到電極表面進行快速的電子傳遞,產生一個很強的電學信號。信號的大小是依據亞甲基藍距離電極表面的遠近來判斷的,實驗證明距離越遠信號越小,反之,則信號越大。這個1:N的靶循環(huán)策略達到了42 fM/L的檢測限,比前一個無酶鏈置換電化學DNA傳感器的檢測限低1個數量級。此外,該策略顯示對單堿基錯配的高選擇性,并且能夠直接在人血清和細胞培養(yǎng)基中檢測低濃度的靶標DNA。將鏈置換反應的高選擇性、酶催化靶循環(huán)放大策略和一步結構轉換讀出信號的高效性整合到一個傳感器中,相信這個集多個優(yōu)勢于一體的傳感器能為基因檢測提供新思路。
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【學位授予單位】：湖北中醫(yī)藥大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：TP212.3;R440

【參考文獻】

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本文編號：2371321