【摘要】：生物傳感器具有傳統(tǒng)檢測(cè)方法不可比擬的優(yōu)勢(shì),在生物醫(yī)學(xué)研究、環(huán)境檢測(cè)、食品安全和發(fā)酵工程等領(lǐng)域已得到廣泛的應(yīng)用。隨著材料科學(xué)的發(fā)展和加工技術(shù)的進(jìn)步,對(duì)生物傳感器的要求除了降低檢測(cè)極限、增強(qiáng)檢測(cè)特異性外,正朝著微型化、簡(jiǎn)約化和方便化的方向發(fā)展。靜電紡絲制備的超細(xì)纖維具有較大的比表面積,有利于功能基團(tuán)的接枝和檢測(cè)物捕獲,其三維多孔結(jié)構(gòu)有利于檢測(cè)介質(zhì)和對(duì)象的滲透,可增加檢測(cè)的靈敏性和響應(yīng)速度。具有聚集誘導(dǎo)發(fā)光(AIE)效應(yīng)的熒光分子可克服普通熒光分子的聚集促使猝滅(ACQ)效應(yīng),同時(shí)其量子產(chǎn)率是普通熒光分子的數(shù)倍。據(jù)此,本論文合成了一系列具有AIE效應(yīng)的新型熒光分子,并且針對(duì)不同的檢測(cè)對(duì)象對(duì)其進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾,將修飾后的AIE分子接枝于靜電紡絲纖維表面構(gòu)建了不同的熒光生物傳感器�；贏IE的發(fā)光機(jī)理,制備了檢測(cè)細(xì)菌的熒光纖維膜;針對(duì)“turn on”或“turn off”檢測(cè)易受外界干擾的問(wèn)題,制備了比率型熒光纖維膜檢測(cè)疾病標(biāo)志物;為了進(jìn)一步降低檢測(cè)極限和響應(yīng)時(shí)間,制備了自放大的熒光檢測(cè)纖維膜和自驅(qū)動(dòng)的雙面短纖維分別檢測(cè)過(guò)氧化氫(H202)和細(xì)菌。合成了帶有三聚氰氯的四苯基乙烯(TPE)衍生物,驗(yàn)證了此TPE衍生物具有AIE效應(yīng),并將其接枝在聚(苯乙烯-馬來(lái)酸酐)(PSMA)纖維上,進(jìn)一步進(jìn)行甘露糖修飾得到纖維膜檢測(cè)載體。纖維表面的甘露糖和大腸桿菌(E.coli)菌毛蛋白特異性結(jié)合,導(dǎo)致纖維膜上的TPE聚集發(fā)光。通過(guò)實(shí)驗(yàn)篩選得出PSMA含量達(dá)到90%時(shí),纖維捕獲細(xì)菌達(dá)到飽和。通過(guò)優(yōu)化纖維表面接枝密度,與不同濃度的細(xì)菌作用后制備纖維膜色帶,根據(jù)纖維膜發(fā)光強(qiáng)度可裸眼判斷細(xì)菌的濃度,細(xì)菌濃度檢測(cè)范圍是102-105CFU/ml。采用羥基化TPE和頭孢菌素類似物為原料合成了帶有頭孢菌素的TPE探針,并證實(shí)了其對(duì)β內(nèi)酰胺酶具有特異性熒光響應(yīng)。在PSMA纖維表面接枝E.coli相關(guān)菌種(耐藥菌E. coli JM109/pUCl9和非耐藥菌E. coli JM109)的特異性核酸適配體,結(jié)果表明可特異性捕獲細(xì)菌,核酸適配體接枝密度影響纖維膜對(duì)細(xì)菌的捕獲能力。耐藥菌內(nèi)的β內(nèi)酰胺酶催化斷裂作用誘導(dǎo)TPE發(fā)光,可對(duì)捕獲在纖維表面上的耐藥菌進(jìn)行顯色,熒光響應(yīng)的裸眼檢測(cè)極限為102 CFU/ml。同時(shí)光照實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,TPE探針產(chǎn)生活性氧(ROS)可以有效殺死耐藥細(xì)菌。聚對(duì)苯二甲酸乙二醇酯(PET)纖維表面胺化后修飾磷酸化的熒光素分子,再吸附帶有季銨鹽的TPE衍生物實(shí)現(xiàn)了熒光素的猝滅和TPE的AIE效應(yīng)。堿性磷酸酶(ALP)脫去磷酸根后熒光素發(fā)光,同時(shí)TPE的AIE效應(yīng)減弱,根據(jù)二者熒光強(qiáng)度的比率可確定ALP濃度。結(jié)果表明表面氨基密度為30 nmol/mg時(shí),纖維對(duì)ALP具有最佳的比率型熒光響應(yīng),檢測(cè)極限為1.5mU/ml,檢測(cè)范圍為0-100mU/ml。當(dāng)ALP的濃度低于80 mU/ml時(shí),纖維色帶的顏色隨著ALP濃度增加而改變,可通過(guò)裸眼判斷血清樣品中的ALP含量。制備了帶有醛基和磺酸基的TPE衍生物,并將其和熒光桃紅B (PhB)同時(shí)共價(jià)接枝在PSMA纖維表面。纖維膜吸附魚(yú)精蛋白后PhB發(fā)生靜態(tài)淬滅,TPE產(chǎn)生AIE效應(yīng)發(fā)射青色熒光。用肝素置換、或胰蛋白酶水解吸附魚(yú)精蛋白后,AIE和靜態(tài)淬滅效應(yīng)均逐漸減弱,PhB開(kāi)始發(fā)射黃色熒光,基于青光和黃光強(qiáng)度比率的變化可確定肝素和胰蛋白酶的濃度。通過(guò)優(yōu)化TPE衍生物和PhB的接枝密度以達(dá)到最佳的檢測(cè)效果。通過(guò)計(jì)算得到肝素的檢測(cè)極限為0.02 U/ml,并且可通過(guò)纖維色帶的顏色轉(zhuǎn)變裸眼判斷0-0.8 U/ml的肝素和0-8 μg/ml的胰蛋白酶,并適用于血清和尿液樣品的直接檢測(cè)。為了進(jìn)一步提高檢測(cè)的靈敏度,將自放大反應(yīng)構(gòu)筑于纖維膜上用于H2O2的檢測(cè)。PET纖維上固定含硼酸的膽堿自放大分子并基于靜電相互作用吸附TPE衍生物,PSMA纖維表面固定膽堿氧化酶(ChOX),兩種纖維的復(fù)合膜用于了 H2O2的檢測(cè)。PET纖維膜吸附TPE衍生物因AIE效應(yīng)發(fā)藍(lán)光,H2O2氧化PET纖維膜上的硼酸基團(tuán)后自放大分子發(fā)生重排,吸附的TPE衍生物和膽堿分子從PET纖維膜上脫落,纖維膜上的熒光減弱;同時(shí)脫落的自由膽堿被PSMA纖維上的ChOX氧化產(chǎn)生H2O2并參與反應(yīng),直至纖維膜上的TPE衍生物全部脫落,根據(jù)纖維膜完全褪色的時(shí)間可以定量檢測(cè)痕量的H2O2。結(jié)果表明TPE的吸附量顯著影響檢測(cè)效果,吸附密度為23 nmol/mg時(shí)檢測(cè)效果最佳;和沒(méi)有放大反應(yīng)的檢測(cè)效果相比,基于放大反應(yīng)在檢測(cè)極限和檢測(cè)時(shí)間方面具有很大優(yōu)勢(shì),對(duì)H2O2的檢測(cè)極限達(dá)到了 0.5μM,且可以根據(jù)褪色時(shí)間定量檢測(cè)0.5-8.0μM的膽堿。為了增加熒光探針和分析物的相互作用,采用自驅(qū)動(dòng)的短纖維作為檢測(cè)載體。采用并列雙針頭制備雙面短纖維,一側(cè)聚合物為PSMA,另一側(cè)為單氨基保護(hù)己二胺修飾的PMSA,將過(guò)氧化氫酶(CAT)和TPE衍生物分別修飾在雙面短纖維兩側(cè)。CAT催化H2O2反應(yīng)生成氧氣推動(dòng)短纖維運(yùn)動(dòng),捕獲細(xì)菌后因聚集作用TPE發(fā)光,構(gòu)筑了對(duì)E.coli特異性響應(yīng)的自驅(qū)動(dòng)微馬達(dá)。通過(guò)系統(tǒng)地研究不同長(zhǎng)度的短纖維運(yùn)動(dòng)情況,表明長(zhǎng)度為10 μm的雙面短纖維均方位移(MSD)最大,熒光響應(yīng)效果最好。通過(guò)研究H2O2濃度對(duì)檢測(cè)效果的影響,確定了 3.5%的H2O2為最佳的燃料濃度。檢測(cè)結(jié)果表明,自驅(qū)動(dòng)雙面短纖維在1分鐘內(nèi)的檢測(cè)極限為65 CFU/ml,檢測(cè)范圍為65-105CFU/ml。綜上所述,本論文基于靜電紡超細(xì)纖維和AIE效應(yīng)的優(yōu)勢(shì)構(gòu)筑了一系列方便、快捷和高效的生物傳感器。制備的新型纖維色帶可裸眼判斷被檢物的濃度范圍,無(wú)需復(fù)雜的實(shí)驗(yàn)設(shè)備,為實(shí)時(shí)、在線的檢測(cè)提供了新的手段。同時(shí),該體系也可通過(guò)熒光檢測(cè)定量表征被檢物的濃度,基于AIE效應(yīng)、熒光強(qiáng)度比率分析、信號(hào)放大反應(yīng)和自驅(qū)動(dòng)載體等手段可提升檢測(cè)靈敏度和響應(yīng)速度,為拓展靜電紡纖維作為生物傳感載體的研究及應(yīng)用提供了新的思路。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：西南交通大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：TP212.3;TQ340.64

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本文編號(hào)：2327715