【摘要】：目的:腫瘤相關DNA存在于患者的血液、唾液、尿液和其他分泌液中,與正常DNA相比,其往往會發(fā)生堿基突變,而檢測目標DNA的堿基突變有助于腫瘤的篩查和腫瘤遠處轉(zhuǎn)移的檢測。由于腫瘤早期體液中的腫瘤DNA表達量很少,因此,尋找一種靈敏、特異的識別方法用于檢測目標DNA的濃度對早期診斷腫瘤有著非常重要的意義。α-凝血酶是一種絲氨酸蛋白酶,它主要參與血液凝血過程,有促凝和抗凝的雙重作用,其在體內(nèi)的異常表達與血栓性疾病的發(fā)生直接相關。然而,目前用于α-凝血酶的檢測方法卻存在操作繁瑣、試劑價格昂貴、不夠靈敏等問題。本研究利用串聯(lián)的分支整合DNA耦合催化發(fā)夾組裝反應(CHA)制成的生物傳感器可直接檢測目標DNA以及人源性α-凝血酶,同時,對傳感器的可行性、靈敏度和特異性進行了分析。方法:1.串聯(lián)體分支整合DNA的形成:目標物分子存在的條件下,打開第一條DNA發(fā)夾H1,H1暴露出能打開發(fā)夾H2的序列并打開發(fā)夾H2,H2暴露出的序列打開發(fā)夾H1進入下一個循環(huán),最終形成一系列串聯(lián)體分支整合DNA。當缺乏目標物時,2種發(fā)夾DNA獨立存在于同一體系中,相互之間不發(fā)生反應。2.CHA反應:串聯(lián)體分支整合DNA上含有自由的緊密靠近的觸發(fā)鏈,可觸發(fā)CHA的發(fā)生。由于一個目標物分子可引發(fā)一條串聯(lián)分支整合DNA鏈形成,而一條分支整合DNA鏈含有多個觸發(fā)鏈,從而觸發(fā)多個CHA反應,實現(xiàn)第一次信號放大。3.類過氧化物酶催化底物反應和信號進一步放大:CHA發(fā)生后,每一條雙鏈DNA產(chǎn)物末端都含有G-四聚體結構,當加入血紅素后,G-四聚體被激活并具有類過氧化物酶的活性。在過氧化氫存在下,其催化ABTS發(fā)生氧化還原反應,從而在418 nm處形成特征性吸收峰。4.可行性分析:利用非變形聚丙烯酰胺凝膠電泳和紫外可見分光光度計表征可行性。5.傳感器檢測的條件優(yōu)化及性能評價:對H1與目標DNA之間互補堿基的長度、H2與H3濃度、CHA的孵育時間和孵育溫度進行優(yōu)化;對傳感器的靈敏度、特異性進行評價。結果:1.非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳結果表明,分步的串聯(lián)體分支整合DNA反應以及CHA反應可行。紫外可見分光光度計進一步證明目標物分子引發(fā)串聯(lián)體分支整合DNA反應,進而由串聯(lián)體上的引發(fā)物鏈引發(fā)CHA的一體化反應可行。2.目標物分子加入后觸發(fā)信號放大反應體系,產(chǎn)生的具有類過氧化物酶活性的G-四聚體DNAzyme催化底物并在418 nm處產(chǎn)生特征性吸收峰,根據(jù)吸收峰強度隨濃度的變化制定了標準曲線。3.基于串聯(lián)體分支整合DNA及CHA的傳感器性能:檢測目標DNA分子的線性范圍是1.0 p M到75 n M,檢測下限為0.14 p M(S/N=3);檢測人源性α-凝血酶的線性范圍是1.0 p M到2.5 n M,檢測下限為0.68 p M(S/N=3);具有單堿基突變識別能力。結論:本實驗研究利用串聯(lián)體分支整合DNA及CHA構建了一種新的生物傳感器檢測目標DNA分子以及人源性α-凝血酶,在這一反應體系內(nèi),比色反應的靈敏度得到顯著提高;在近端錯配識別的作用下,展現(xiàn)出了很高的特異性,實現(xiàn)了單堿基錯配識別性能;和傳統(tǒng)比色實驗相比,本實驗設計的傳感器具有低檢測限、高特異性、操作簡便,無需沖洗等步驟;本傳感器在臨床生物醫(yī)學研究,腫瘤標志物檢測,法醫(yī)檢測中具有很高的應用潛力。
[Abstract]:Objective : To study the feasibility , sensitivity and specificity of DNA . 1 . The results of non - denaturing polyacrylamide gel electrophoresis show that the branched integration of DNA and CHA is feasible . The UV - Vis spectrophotometer further proves that the target molecule - induced tandem branch integrates the DNA reaction , and then the detection limit is 0 . 14 p M ( S / N = 3 ) . The detection limit is 0 . 14 p M ( S / N = 3 ) .
【學位授予單位】：重慶醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：TP212.3;R446

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1 白書連;利用催化發(fā)夾組裝的生物傳感器檢測目標DNA和人源性α-凝血酶[D];重慶醫(yī)科大學;2017年

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本文編號：2122257