本文選題：核酸分析　切入點：熒光生物傳感器　出處：《湖北中醫(yī)藥大學(xué)》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：遺傳信息以特定核苷酸序列的形式貯存在核酸分子中,對核酸分子的序列、結(jié)構(gòu)及含量的分析在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中有重要的應(yīng)用價值,如疾病早期預(yù)防、腫瘤早期診斷、各種相關(guān)疾病診斷、療效監(jiān)測以及個體化治療等。特定序列的核酸分子能夠識別目標(biāo)分子或催化某些反應(yīng),基于核酸的特異識別作用從而設(shè)計和發(fā)展各種快速簡單的核酸分析方法一直以來都是分子診斷技術(shù)方面關(guān)注的熱點。傳統(tǒng)的核酸分析方法包括毛細(xì)管電泳法、變性高效液相色譜法、DNA微陣列法、變性梯度凝膠電泳法和溫度梯度凝膠電泳法等,這些方法大都是在PCR的基礎(chǔ)上實現(xiàn)核酸分析。然而這些傳統(tǒng)的核酸分析方法存在以下主要缺陷:需要較多較純的PCR產(chǎn)物、實驗成本高、實驗步驟繁瑣以及耗時等。近年來,一些新型核酸分析方法克服了傳統(tǒng)方法的不足,其中,DNA生物傳感器因其實驗成本較低、靈敏度高、特異性好等優(yōu)勢在核酸分析領(lǐng)域得到快速發(fā)展。與其他DNA生物傳感器相比,熒光DNA生物傳感器在核酸分析診斷中應(yīng)用較廣泛,因為該傳感器有其獨特的優(yōu)勢,比如樣品前處理容易、實驗操作簡單、響應(yīng)迅速、易與其他方法聯(lián)用以及無需參比器件等。在熒光傳感技術(shù)中,熒光探針發(fā)揮著重要的作用,而傳統(tǒng)熒光探針在應(yīng)用于生物傳感等研究時,聚集誘導(dǎo)猝滅(ACQ)現(xiàn)象是其研究發(fā)展中最大的阻礙。20世紀(jì)80年代末90年代初,納米技術(shù)逐步應(yīng)用于生物傳感器領(lǐng)域,并已取得了突破性的進(jìn)展,其中納米材料的應(yīng)用是納米生物傳感技術(shù)領(lǐng)域最具活力、最有潛力、最有研究價值的一個分支。隨著2004年英國兩位科學(xué)家Konstantin Novoselon和Andre K.Geim發(fā)現(xiàn)了石墨烯,使類石墨烯二維納米材料,尤其是過渡金屬二硫化物納米材料(Transition metal dichalcogenides,TMDs)在生物傳感技術(shù)中的應(yīng)用逐步被重視。相對于石墨烯,TMDs可以很容易地大規(guī)模合成并直接分散在水溶液中,而無需表面活性劑或氧化等額外復(fù)雜的處理。除此之外,TMDs因其優(yōu)良的猝滅能力在熒光納米生物傳感領(lǐng)域中非常有前景,而二硫化鉬又是TMDs最典型且常用的代表材料。本工作中,將二硫化鉬納米片與熒光探針相結(jié)合,利用MoS_2其較高的猝滅能力和能有效的區(qū)分ss-DNA和ds-DNA的特性,以及后來對熒光探針的改良,致力于提高檢測靈敏度和特異性等,發(fā)展了一系列分別以DNA甲基化和DNA為檢測對象的簡單快速核酸分析的熒光生物傳感技術(shù)。具體研究內(nèi)容分別如下:(1)基于二硫化鉬熒光生物傳感器用于DNA甲基化的快速分析DNA甲基化是一種重要的腫瘤標(biāo)志物,建立一種簡單、快速和靈敏的DNA甲基化分析方法較為重要。Bst UI,是一種對人類5’-CGCG-3’位點敏感的限制性內(nèi)切酶,然而當(dāng)此位點發(fā)生半/全甲基化時其酶切功能喪失。設(shè)計以熒光素標(biāo)記的DNA為探針,二硫化鉬納米片為熒光猝滅劑和傳感平臺,利用限制性內(nèi)切酶Bst UI特異性剪切能力,建立一種簡單的熒光傳感方法用于在勻相中對p16啟動子DNA甲基化快速分析。該傳感方法展現(xiàn)了不錯的靈敏度,可用于區(qū)分低至1%的甲基化水平級別的混合物。相比之前報道甲基化水平分析,這種巧妙地免亞硫酸鹽處理的設(shè)計不僅可以避免PCR的局限性,而且具有良好的特異性,靈敏度高,檢測時間短(3h)和操作方便等的優(yōu)點。(2)基于聚集誘導(dǎo)發(fā)光探針和二硫化鉬的DNA生物傳感器的初步研究在以MoS_2為檢測平臺的基礎(chǔ)上,對傳統(tǒng)熒光探針的改良是本章研究的重點。TPE分子的合成成本低廉,免標(biāo)記的熒光探針能克服傳統(tǒng)熒光探針諸如ACQ現(xiàn)象、光漂白等問題。以四苯乙烯(TPE)衍生物與DNA相結(jié)合為免標(biāo)記的熒光探針,二硫化鉬納米片為熒光猝滅劑和傳感平臺,利用TPE的聚集誘導(dǎo)發(fā)光(AIE)效應(yīng)建立一種免熒光標(biāo)記的熒光核酸生物傳感器。TPE作為典型的AIE分子,它在分散溶液中不發(fā)光或發(fā)微弱的光,但是當(dāng)加入DNA時,則DNA和探針聚集形成復(fù)合物,發(fā)射很強的熒光信號。但是TPE對單鏈DNA和雙鏈DNA無任何選擇性。于是,可以通過二硫化鉬納米片的高熒光猝滅效率和對單、雙鏈核酸的選擇性吸附作用,從而實現(xiàn)免標(biāo)記熒光核酸分析。由于本課題只是初步構(gòu)建了基于TPE探針和二硫化鉬的DNA生物傳感器,目前已比較三種常用TPE衍生物的信噪比選擇出適合本實驗的AIE分子,并通過熒光光譜圖證明了本方法具有較好的可行性。在今后的研究中,繼續(xù)深入實驗條件的優(yōu)化,實驗靈敏度和特異性以及臨床實際樣本的研究。
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【學(xué)位授予單位】：湖北中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R440;TP212.3

【參考文獻(xiàn)】

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1 夏祥華;孫漢文;;基于遺傳算法的曲線擬合方法用于重疊熒光光譜的定量解析[J];光譜學(xué)與光譜分析;2012年08期

2 覃小梅;;分子診斷學(xué)在臨床醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用進(jìn)展[J];內(nèi)科;2011年02期

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本文編號：1638890