發(fā)布時(shí)間：2018-03-17 04:22

  本文選題：光纖光度檢測(cè)　切入點(diǎn)：自由活動(dòng)小鼠　出處：《天津醫(yī)科大學(xué)》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：研究目的 光纖光度檢測(cè)技術(shù)是一種適用于檢測(cè)自由活動(dòng)動(dòng)物深部腦區(qū)一群神經(jīng)細(xì)胞Ca2+活動(dòng)的信號(hào)探測(cè)技術(shù)。本文將癲癇發(fā)生的Ca2+假說作為理論依據(jù),旨在利用光纖光度檢測(cè)技術(shù)探究自由活動(dòng)小鼠在海人酸(Kainic acid,KA)誘發(fā)的小鼠急性癇性發(fā)作前、后其病灶區(qū)海馬(Hippocampus,HPC)、內(nèi)嗅皮層(Entorhinal cortex,EC)的鈣信號(hào),為自由活動(dòng)動(dòng)物這一研究水平下癲癇發(fā)生的相關(guān)研究提供新的研究方法和理論支持。研究?jī)?nèi)容 1.光纖光度檢測(cè)裝置的搭建與信噪比(Signal-noise ratio,SNR)優(yōu)化;2.適用于光纖光度檢測(cè)技術(shù)的KA急性致癇方法的篩選;3.自由活動(dòng)小鼠HPC-CA3、CA1、齒狀回(Dentate gyrus,DG)區(qū)和EC的癇樣鈣信號(hào)及其與急性癇性發(fā)作行為的關(guān)系。研究方法 1.組裝與調(diào)試光纖光度檢測(cè)裝置,分別利用光功率計(jì)、人工散射樣品和麻醉動(dòng)物樣品測(cè)試裝置的光纖耦合效率、熒光收集效率和SNR。2.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組:實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為2月齡雄性C57BL/6小鼠,用于比較不同給藥方式致癇結(jié)果的動(dòng)物隨機(jī)分為4組:顱內(nèi)KA局部給藥組、顱內(nèi)生理鹽水對(duì)照組、全身系統(tǒng)給藥低劑量組和全身系統(tǒng)給藥高劑量組;用于進(jìn)行鈣信號(hào)記錄實(shí)驗(yàn)的動(dòng)物按照目標(biāo)記錄位點(diǎn)隨機(jī)分為4組:CA3組、CA1組、DG組和EC組。3.KA誘發(fā)小鼠急性癇性發(fā)作的方法和行為學(xué)評(píng)價(jià):顱內(nèi)KA局部給藥組和生理鹽水對(duì)照組的動(dòng)物提前行開顱手術(shù)預(yù)植入用于給藥的套管,待動(dòng)物從術(shù)中恢復(fù)3~5天后,在小鼠清醒狀態(tài)下利用微量注射泵和注射內(nèi)管在小鼠顱內(nèi)給予0.5μl 2m M的KA溶液或0.5μl生理鹽水;全身系統(tǒng)給藥低劑量組和高劑量組動(dòng)物分別皮下注射15mg/kg、20mg/kg劑量的KA溶液。攝錄4組小鼠KA給藥前30min和給藥后2h的行為表現(xiàn),按照改進(jìn)的Racine分級(jí)法對(duì)小鼠癇性發(fā)作的嚴(yán)重程度進(jìn)行評(píng)分,小鼠出現(xiàn)了Ⅰ級(jí)及以上發(fā)作即認(rèn)為是被誘發(fā)了癇性發(fā)作。將Ⅲ級(jí)及以上發(fā)作稱為抽搐性運(yùn)動(dòng)發(fā)作(Convulsive motor seizures,CMS),根據(jù)小鼠KA給藥后2h內(nèi)達(dá)到CMS和達(dá)到Ⅴ級(jí)發(fā)作的比例、每組動(dòng)物達(dá)到CMS的平均發(fā)作次數(shù)和每次CMS的平均發(fā)作時(shí)長(zhǎng),評(píng)估并篩選適用于光纖光度檢測(cè)技術(shù)的致癇方法。4.鈣信號(hào)記錄和急性癇性發(fā)作行為研究:對(duì)動(dòng)物實(shí)施開顱手術(shù)后在目標(biāo)記錄位點(diǎn)微量注射Ca2+指示劑OGB-1 AM,并將光纖植入在被指示劑負(fù)載的神經(jīng)細(xì)胞上方。用牙科水泥將光纖固定在小鼠顱骨上,待動(dòng)物完全恢復(fù)清醒后放入行為學(xué)觀察裝置。利用光纖光度檢測(cè)裝置和鈣信號(hào)記錄軟件記錄小鼠自由活動(dòng)時(shí)目標(biāo)腦區(qū)KA給藥前30min自發(fā)的正常鈣信號(hào)和KA給藥后2h內(nèi)誘發(fā)的癇樣鈣信號(hào),比較KA給藥前、后鈣信號(hào)的幅值。整個(gè)過程中同步攝錄小鼠的行為表現(xiàn),分析癇樣鈣信號(hào)與小鼠急性癇性發(fā)作行為的關(guān)系。5.鈣信號(hào)分析與統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法:利用基于Lab VIEW編寫的鈣信號(hào)分析軟件讀取和分析記錄到的鈣信號(hào),其幅值用△F/F表示。對(duì)篩選致癇方法研究中各組間達(dá)到CMS的發(fā)作次數(shù)和每次CMS的平均發(fā)作時(shí)長(zhǎng)的比較進(jìn)行單因素方差分析;對(duì)KA給藥前、后的鈣信號(hào)幅值進(jìn)行配對(duì)樣本的非參數(shù)檢驗(yàn)。研究結(jié)果 1.本實(shí)驗(yàn)室自主搭建的光纖光度檢測(cè)裝置光纖耦合效率約為3%,熒光收集效率約為20%,最小SNR約為7.6d B,滿足實(shí)驗(yàn)需求。2.KA誘發(fā)小鼠急性癇性發(fā)作的方法篩選研究中,KA局部給藥組小鼠均達(dá)到CMS發(fā)作,CMS的平均發(fā)作次數(shù)為9±2.14次,每次平均發(fā)作時(shí)長(zhǎng)為61±12.82s,且小鼠均發(fā)展為Ⅴ級(jí)發(fā)作;低劑量全身給藥組動(dòng)物僅有75%達(dá)到了CMS發(fā)作,CMS的平均發(fā)作次數(shù)和每次發(fā)作的平均時(shí)長(zhǎng)分別為3±1.85次和31±8.80s,僅有25%的動(dòng)物發(fā)展為Ⅴ級(jí)發(fā)作;高劑量全身給藥組動(dòng)物均達(dá)到CMS發(fā)作,CMS的平均發(fā)作次數(shù)為5±1.63次,每次平均發(fā)作時(shí)長(zhǎng)為33±7.54s,有40%的小鼠發(fā)展為Ⅴ級(jí)發(fā)作。其中KA局部給藥組小鼠CMS的平均發(fā)作次數(shù)以及每次CMS發(fā)作的平均時(shí)長(zhǎng)均與全身給藥組有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。3.與小鼠自由活動(dòng)時(shí)正常的無節(jié)律的鈣信號(hào)不同,KA給藥誘發(fā)的癇樣鈣信號(hào)主要表現(xiàn)出四種模式,包括鈣積聚、大/小型鈣波、高頻脈沖樣鈣信號(hào)和低頻脈沖樣鈣信號(hào)。不同模式的癇樣信號(hào)無腦區(qū)特異性,但在不同腦區(qū)的組合方式有所差異,例如HPC-CA3、CA1區(qū)的鈣積聚與大型鈣波總是連續(xù)相伴出現(xiàn),DG區(qū)的大型鈣波較為平滑,EC區(qū)的高頻脈沖樣鈣信號(hào)總是與小型鈣波同步出現(xiàn)等。小鼠自由活動(dòng)時(shí),HPC-CA3區(qū)正常鈣信號(hào)和KA誘發(fā)的癇樣鈣信號(hào)的平均幅值分別為1.18±0.40%和4.75±3.88%;CA1區(qū)正常鈣信號(hào)的平均幅值為1.59±0.19%,KA給藥后記錄到的癇樣鈣信號(hào)平均幅值為13.88±9.78%;DG區(qū)正常鈣信號(hào)和給藥后癇樣鈣信號(hào)的平均幅值分別為1.36±0.42%和6.36±3.56%;小鼠EC正常的鈣信號(hào)幅值和給藥后的癇樣鈣信號(hào)的平均幅值分別為為2.23±0.55%和7.51±2.54%。各記錄位點(diǎn)KA誘發(fā)的癇樣鈣信號(hào)平均幅值均顯著高于正常鈣信號(hào)的幅值。4.HPC-CA3的鈣積聚信號(hào)在小鼠有點(diǎn)頭等明顯的癇性發(fā)作動(dòng)作前至少提前10s出現(xiàn),而EC伴隨有高頻脈沖樣鈣信號(hào)的小型鈣波與小鼠的癇性發(fā)作動(dòng)作同時(shí)發(fā)生。結(jié)論 光纖光度檢測(cè)技術(shù)可以有效地應(yīng)用于自由活動(dòng)動(dòng)物急性癇性發(fā)作時(shí)深部腦區(qū)(深度≥4mm)神經(jīng)細(xì)胞的鈣信號(hào)記錄。以20mg/kg劑量進(jìn)行KA皮下給藥的方法適用于在鈣信號(hào)記錄過程中誘發(fā)小鼠急性癇性發(fā)作。在小鼠表現(xiàn)出CMS動(dòng)作之前,KA已經(jīng)造成了HPC-CA3區(qū)神經(jīng)細(xì)胞的活動(dòng)異常。
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【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R742.1;TN911.6

【參考文獻(xiàn)】

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1 常琳;王小姍;;中國(guó)癲癇流行病學(xué)調(diào)查研究進(jìn)展[J];國(guó)際神經(jīng)病學(xué)神經(jīng)外科學(xué)雜志;2012年02期

2 史娟;李繼碩;;細(xì)胞內(nèi)鈣成像和鈣測(cè)定的基本原理及應(yīng)用[J];神經(jīng)解剖學(xué)雜志;2006年04期

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本文編號(hào)：1623154