發(fā)布時間：2020-06-19 04:47

【摘要】：庫爾勒香梨鮮嫩多汁,香甜可口,深受廣大消費者的喜愛,目前已出口到多個國家和地區(qū),可實現(xiàn)一年四季的銷售。但在貯藏、銷售過程中,梨果實極易受到多種病害的影響,其中,由鏈格孢菌(A.alternata)侵染引起的黑斑病是一種最嚴(yán)重的貯藏期病害。黑斑病的發(fā)生降低了香梨果實的品質(zhì)與商品價值,影響其銷售,造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。因此,開展香梨果實黑斑病發(fā)病過程監(jiān)測與快速檢測方法研究,實現(xiàn)香梨采后病害動態(tài)監(jiān)測與早期快速檢測,對香梨果實病害防治及提高市售果實品質(zhì)具有十分重要的意義。本論文以庫爾勒香梨果實為研究對象,首先,采用高光譜成像(HSI)技術(shù)從宏觀角度對香梨果實黑斑病發(fā)病過程進(jìn)行動態(tài)監(jiān)測,建立病害早期檢測方法;其次,借助共聚焦顯微拉曼光譜(CRM)和拉曼化學(xué)成像技術(shù)對黑斑病發(fā)病過程中香梨果實細(xì)胞壁成分和結(jié)構(gòu)變化進(jìn)行研究;再次,基于表面增強拉曼光譜(SERS)對A.alternata侵染產(chǎn)生的交鏈孢酚及黑斑病發(fā)病過程中香梨果實多酚氧化酶(PPO)活性變化進(jìn)行準(zhǔn)確測定;最后,利用SERS對香梨果實中A.alternata含量進(jìn)行快速檢測。主要研究內(nèi)容和結(jié)果如下:(1)基于HSI技術(shù)的梨黑斑病發(fā)病過程監(jiān)測及病害早期檢測。1)利用HSI系統(tǒng)采集不同染病階段梨果實的高光譜圖像;2)創(chuàng)新地采用光譜角填圖(SAM)算法對采集到的高光譜圖像進(jìn)行可視化,識別染病區(qū)域;3)利用主成分分析(PCA)來判斷基于HSI技術(shù)識別不同染病階段梨果實的可行性,再利用偏最小二乘判別分析(PLSDA)、k最近鄰(KNN)和支持向量機(SVM)算法建立梨果實黑斑病病害早期檢測的分類模型。結(jié)果表明,借助SAM可完成對不同染病階段病害果實染病區(qū)域的識別,從而實現(xiàn)對梨果實黑斑病發(fā)病過程的實時監(jiān)測;PLSDA、KNN和SVM三種分類模型均可用于對不同染病階段梨果實的分類,但它們的分類精度相差較大。三種模型中,SVM的區(qū)分性能最好,其基于全波段光譜和最優(yōu)波長建模的精度分別為97.50%和96.56%,可實現(xiàn)對梨果實黑斑病病害的早期檢測。(2)借助拉曼成像技術(shù)對發(fā)病過程中梨果實細(xì)胞壁成分變化的微觀檢測。1)利用CRM采集新鮮、染病早期和晚期梨果實細(xì)胞壁的拉曼光譜,借助標(biāo)準(zhǔn)品的拉曼光譜和相關(guān)文獻(xiàn)報道確定梨果實細(xì)胞壁拉曼峰的歸屬,計算發(fā)病過程中纖維素和果膠拉曼特征峰強度變化的程度;2)利用PCA對不同染病階段梨果實細(xì)胞壁拉曼光譜進(jìn)行分類;3)對梨果實細(xì)胞壁主要成分(多糖、纖維素和果膠)進(jìn)行拉曼化學(xué)成像,觀察梨果實細(xì)胞壁在發(fā)病過程中的細(xì)微變化。結(jié)果表明,黑斑病發(fā)病過程中細(xì)胞壁主要化學(xué)成分的含量顯著下降,與新鮮果實相比,接種后的第2和第8天,染病果實細(xì)胞壁纖維素拉曼特征峰強度分別降低了19.11%和58.50%,果膠拉曼特征峰強度分別降低了19.20%和58.67%;拉曼化學(xué)成像結(jié)果顯示,發(fā)病過程中梨果實細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)受損,空間有序結(jié)構(gòu)遭到破壞,多種成分分布不均勻且變得松散。(3)基于SERS對A.alternata侵染產(chǎn)生交鏈孢酚的檢測。1)制備銀納米顆粒(AgNPs)溶膠,通過吡啶修飾AgNPs溶膠來解決基底與目標(biāo)分析物吸附力弱的問題;2)建立SERS強度與交鏈孢酚標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度的定量關(guān)系,通過加標(biāo)回收實驗來驗證其在梨果實中交鏈孢酚檢測的可行性;3)采用SERS對三種不同香梨果實樣品中交鏈孢酚進(jìn)行檢測,并通過HPLC分析來驗證SERS對實際樣品檢測結(jié)果的可靠性。結(jié)果表明,經(jīng)吡啶修飾的AgNPs很好地解決交鏈孢酚在AgNPs表面上吸附能力弱的問題,從而提高檢測靈敏度、降低檢測限。SERS對交鏈孢酚檢測結(jié)果:SERS強度與交鏈孢酚溶液濃度的關(guān)系為I=1453.7 log c-553.4,其決定系數(shù)R~2為0.9926,線性范圍為3.16-316.0μg/L,檢測限為1.30μg/L(低于HPLC分析的檢測限)。此外,SERS還成功用于香梨果實中交鏈孢酚的快速檢測,其結(jié)果與HPLC分析所得的結(jié)果比較接近,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于10%。(4)基于SERS對發(fā)病過程中梨果實PPO活性變化的測定。1)制備一種常用的AgNPs溶膠,將其用作SERS對鄰苯二酚測定的基底,確定用于PPO活性測定的最佳鄰苯二酚濃度范圍;2)采集反應(yīng)介質(zhì)在不同反應(yīng)階段的SERS信號,并建立SERS強度減量(ΔI)與PPO活性(E_c)之間的關(guān)系;3)依據(jù)所建立的關(guān)系對香梨果實樣品中PPO活性進(jìn)行測定,同時與比色法結(jié)果對比分析;4)明確黑斑病發(fā)病過程中香梨果實PPO活性變化的規(guī)律。結(jié)果表明,用于PPO活性測定最佳的鄰苯二酚濃度范圍為1.0-9.0 mM;對PPO標(biāo)準(zhǔn)溶液測定得到SERS強度減量與PPO活性的線性回歸方程為logΔI/Δt=0.6223 log E_c+0.8072,其決定系數(shù)為0.9689,線性范圍為500-50000 U/L,檢測限為224.65 U/L;SERS可用于香梨果實PPO活性的準(zhǔn)確測定,其測定結(jié)果穩(wěn)定性比比色法要好;且能夠?qū)崿F(xiàn)對黑斑病發(fā)病過程中PPO活性變化的靈敏測定,在接種后的第2天,香梨果實的PPO活性達(dá)到高峰值;草酸處理可以增強染病果實的PPO活性,并能延長PPO活性處于高峰值的時間。(5)基于SERS對梨果實中A.alternata的快速檢測。1)制備銀納米點陣列基底,并優(yōu)化基底的顆粒大小與厚度,以獲得理想的SERS增強效果和重現(xiàn)性;2)測定水和香梨果實中不同濃度A.alternata的SERS信號,建立SERS信號強度與A.alternata濃度之間的關(guān)系,實現(xiàn)A.alternata的快速檢測;3)通過拉曼成像對不同濃度A.alternata進(jìn)行可視化檢測。結(jié)果表明,SERS可用于A.alternata菌懸液的快速檢測,其擬合方程為y=-18.84 x~2+665.38 x-1813.12,決定系數(shù)為0.9511,檢測范圍為1.0×10~3-1.0×10~7 cfu/mL,檢測限低至1.0×10~3 cfu/mL;通過拉曼成像可檢測到A.alternata菌懸液最低濃度為1.0×10~4 cfu/mL,適宜的檢測范圍為1.0×10~4-1.0×10~7 cfu/mL。對人工污染香梨果實汁液檢測的結(jié)果如下:SERS強度與汁液中A.alternata濃度的擬合方程為y=-29.27 x~2+511.47 x-1435.18,決定系數(shù)為0.9852,檢測限低于10~4 cfu/mL。開展香梨黑斑病發(fā)病過程監(jiān)測與快速檢測方法研究,實現(xiàn)香梨果實采后病害的動態(tài)監(jiān)測及發(fā)病過程中生理生化指標(biāo)的快速檢測,其研究成果為病原菌侵染及果實發(fā)病機理研究提供理論依據(jù),對香梨果實采后病害防治及提高市售果實品質(zhì)具有現(xiàn)實意義和指導(dǎo)作用,對庫爾勒香梨產(chǎn)業(yè)發(fā)展有很好的推動作用。
【學(xué)位授予單位】：華南理工大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：TS255.7;O433
【圖文】：

病害的檢測[79-81]。王斌等[82]研究利用 HSI 技術(shù)對腐爛、病害及正常梨棗進(jìn)行分類，其分類準(zhǔn)確率達(dá)到 99.12%。孫海霞等[83]基于 HSI 和卷積神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)對鮮棗黑斑病檢測，其模型的判別正確率在 90.0%以上。另外，HSI 技術(shù)還應(yīng)用于桃子[84-86]、蘋果[87-89]等多種果實病害的檢測。1.3 拉曼光譜技術(shù)概論單色光和物質(zhì)分子之間相互作用包括吸收、散射、光致發(fā)光和熒光等多種形式。其中，光子與物質(zhì)分子相互作用的散射作用可分為彈性散射和非彈性散射兩種。彈性散射只改變?nèi)肷涔庾拥姆较�，沒有能量損失，也叫瑞利散射；非彈性散射不僅改變?nèi)肷涔庾拥姆较�，同時還改變光子的能量，使得光子的頻率升高或降低。其中，光子能量減少的叫做斯托克斯散射，而能量增大的叫做反斯托克斯散射，非彈性散射中的斯托克斯散射和反斯托克斯散射統(tǒng)稱為拉曼散射。拉曼散射現(xiàn)象是 1928 年由科學(xué)家 Raman 發(fā)現(xiàn)的[90]瑞利散射和拉曼散射的產(chǎn)生如圖 1-2 所示。

技術(shù)路線圖

【參考文獻(xiàn)】

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1 馬海波;張祥林;王

本文編號：2720323