【摘要】：甲基化修飾是蛋白質翻譯后修飾中的一種,在表觀遺傳調控中起著非常重要的作用,其機制研究受到廣泛關注。核磁共振技術具有非侵入性,可提供近原位環(huán)境下蛋白質原子分辨率結構信息,在蛋白甲基化修飾研究中應用越來越廣泛。然而,蛋白甲基化修飾的NMR檢測往往需要同位素標記,很多蛋白的選擇性標記困難,不具有普適性。這里我們采用最高量子相關譜(MAXY)在近原位環(huán)境下研究蛋白質的甲基化過程。由于MAXY譜中甲基基團最高量子態(tài)為四量子態(tài),高于其他支鏈基團,可通過相干路徑選擇實現(xiàn)甲基信號的選擇性檢測。修飾甲基的化學位移特殊,遠離其他支鏈甲基,使得原本二維譜檢測簡化成一維譜檢測,大大提高了時間分辨率,有利于動態(tài)過程的實時檢測;同時,支鏈甲基分布在分子表面,是很重要的相互作用和結構變化探針,因此該技術提供了一種簡化的探針,可用于天然豐度蛋白質的構象和動力學研究。據此,我們分別以組蛋白和細胞色素c為對象展開了相關研究,主要研究內容及其結果如下:(1)組蛋白H3K4甲基化過程的實時檢測:組蛋白是核小體的重要組成部分,甲基化是其最重要的翻譯后修飾之一。組蛋白不僅甲基化位點多樣,而且同一甲基化位點可以發(fā)生不同程度地甲基化。組蛋白不同程度、不同位點的甲基化具有不同的表觀遺傳調控功能。當前NMR技術可在近原位環(huán)境檢測組蛋白Lys的甲基化過程,但通常需要選擇性同位素標記Lys。對此,我們采用1H-13C MAXY技術,通過四量子濾波,實現(xiàn)了天然豐度蛋白質的組蛋白H3多肽甲基化程度及其甲基化過程的實時檢測。對不同程度甲基化多肽的檢測結果表明,甲基化修飾基團的化學位移通常遠離常規(guī)支鏈甲基所處區(qū)域,處在支鏈CH區(qū)域,且不同程度甲基化基團的化學位移差異大。對稀溶液和細胞裂解液中組蛋白H3多肽的甲基化實時檢測結果發(fā)現(xiàn),該技術可消除復雜的背景信號干擾,在近生理條件(細胞裂解液)實現(xiàn)組蛋白的甲基化過程的實時動態(tài)觀測。裂解液中H3的甲基化速率和程度均與稀溶液有很大差異,表明復雜環(huán)境影響組蛋白的甲基化。(2)基于MAXY表征細胞色素c的構象變化:細胞色素c是一個重要的多功能蛋白,它在呼吸鏈及細胞凋亡中均發(fā)揮著重要功能。細胞色素c的構象變化與其功能密切相關,表征細胞色素c的構象變化對于明確其發(fā)揮相關功能的分子機制至關重要。NMR是在近原位環(huán)境下表征蛋白構象的重要工具,但通常需要13C/15N等同位素標記。由于野生型細胞色素c存在翻譯后修飾,故其同位素標記困難。在本文,我們嘗試使用甲基化選擇性檢測1H-13C MAXY核磁共振技術來表征天然提純的野生型細胞色素c的構象變化。通過1H-13C MAXY核磁共振技術得到的甲基譜圖甲基信號分散性好,有效的濾掉了亞甲基、次甲基等其他信號,減少了譜峰的重疊程度,信號識別簡單明了。通過突變體以及同位素標記,我們實現(xiàn)了對突變體細胞色素c的支鏈甲基歸屬。對突變體與野生型細胞色素c的甲基信號,我們發(fā)現(xiàn)兩者信號幾乎一致,從而指認得到了野生型細胞色素c的甲基信號。該結果表明野生型細胞色素c氧化態(tài)的構象與還原態(tài)的構象明顯不同。
【圖文】：

配位結合丟失，使Ｃｙｔｃ獲得過氧化物酶活性。Ｃｙｔｃ氧化心磷脂（ＣＬ）的�；滃义仙系牟伙柡玩I，破壞膜的完整性。Ｃｙｔｃ釋放至細胞質中，與凋亡蛋白酶激活因逡逑子１邋（Ａｐａｆ－１）結合形成凋亡小體，繼續(xù)凋亡途徑，最終導致細胞凋亡。逡逑多年以來，人們發(fā)現(xiàn)在酸＿或乙醇剛處理后，Ｃｙｔｃ會形成二聚結構。最近，逡逑人們已發(fā)現(xiàn)一個馬的Ｃｙｔｃ于Ｃ端形成的二聚體的Ｘ射線晶體結構＃１。有趣的是，，逡逑二聚體的連接部位處于Ｑ－Ｉ00ｐ區(qū)，會導致Ｍｅｔ８０－ｈｅｍｅ配位結合丟失，并產生過逡逑氧化物酶活性。事實上，人們己知二聚體Ｃｙｔｃ會與線粒體膜有相互作用［４５］。與逡逑單體Ｃｙｔｃ［４６］相比，二聚體Ｃｙｔｃ也顯示出過氧化物酶活性的增加。其他研宄表明，逡逑單體Ｃｙｔｃ在與膜上心磷脂（ＣＬ）相互作用時，構象變得更為舒展ｔ４７，４８］，并且與逡逑二聚體Ｃｙｔｃ的亞單位Ｘ射線晶體結構［４４］很類似。這表明二聚體Ｃｙｔｃ對于理解由逡逑Ｃｙｔｃ與ＣＬ之間的相互作用導致的過氧化物酶活性有重要作用。逡逑＊－ｓ７３逡逑

分別選取了不同程度甲基化Ｈ３多肽作為樣品，對相應方法的可行性進行分析。逡逑天然豐度的邋Ｈ３（ａａｌ－２０）Ｋ４Ｍｅｌ，Ｈ３（ａａｌ－２０）邋Ｋ４Ｍｅ２，邋Ｈ３（ａａｌ－２０）邋Ｋ４Ｍｅ３邋的邋ＨＭＱＣ逡逑譜圖與ＭＡＸＹ譜圖如圖２．１所示。由圖可知，ＨＭＱＣ背景復雜，修飾甲基周圍逡逑存在亞甲基，次甲基信號，與之相比，ＭＡＸＹ譜圖極度簡化，譜峰數量大大降逡逑低。這主要是因為采用了四量子濾波，其他亞甲基和次甲基信號均被消除造成。逡逑僅組蛋白Ｈ３（ａａｌ－２０）的Ｋ４位單、雙、三甲基化信號和支鏈甲基得到了選擇性觀逡逑測。甲基化修飾基團的化學位移遠離常規(guī)支鏈甲基，且甲基化程度不同，其化學逡逑位移也有很大差異。如三甲基修飾的化學位移的１Ｈ和１３Ｃ的化學位移分別為３．０逡逑和５３．０ｐｐｍ，雙甲基化修飾基團的４和１３Ｃ的化學位移分別為２．８和４．２ｐｐｍ，而逡逑支鏈甲基的１Ｈ和１３Ｃ的化學位移分別＜１．５和２５．０ＰＰｍ，這主要是因為修飾基團逡逑是發(fā)生在支鏈Ｎ原子上，Ｎ的吸電子特性使其化學位移增大，靠近其他支鏈亞逡逑１６逡逑
【學位授予單位】：中國科學院大學(中國科學院武漢物理與數學研究所)
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：Q75;O482.532

【相似文獻】

相關期刊論文 前10條

1 王科云;葉明亮;鄒漢法;;蛋白質甲基化修飾的蛋白質組學分析方法新進展[J];色譜;2016年12期

2 鄭杰;;組蛋白賴氨酸甲基化修飾與腫瘤[J];生命科學;2008年03期

3 盛偉;馬端;;組蛋白賴氨酸甲基化修飾與先天性心臟病研究進展[J];遺傳;2010年07期

4 梁琳;盧光t;;組蛋白甲基化的研究進展[J];現(xiàn)代生物醫(yī)學進展;2009年10期

5 倪健宏;楊永林;白丁平;;乙�；⒓谆揎椗c肌肉發(fā)育及分化研究進展[J];新疆農墾科技;2008年06期

6 居玲莎;李仁奇;楊建軍;徐建國;;DNA甲基化修飾在學習記憶中的作用[J];臨床麻醉學雜志;2015年08期

7 胡濟梁;楊煥杰;Jinye Mu;Tiancong Lu;Juli Peng;Xian Deng;孔照勝;鮑時來;曹曉風;左建儒;;一氧化氮通過調控蛋白質甲基化修飾介導植物脅迫反應[J];科學新聞;2018年04期

8 程智逵;過倩萍;伍會健;;組蛋白精氨酸甲基化修飾對基因轉錄的調控[J];生物化學與生物物理進展;2008年11期

9 肖傳樂;Song Zhu;Minghui He;De Chen;Qian Zhang;Ying Chen;Guoliang Yu;Jinbao Liu;Shang-Qian Xie;Feng Luo;Zhe Liang;De-Peng Wang;伯曉晨;谷曉峰;王凱;晏光榮;;人類基因組DNA中的6mA甲基化修飾[J];科學新聞;2019年02期

10 王巍;牛燕媚;傅力;;DNA甲基化修飾與代謝相關疾病的關系及運動干預展望[J];中國運動醫(yī)學雜志;2012年08期

相關會議論文 前10條

1 劉建釗;;信使RNA m~6A甲基化修飾特異性的研究[A];第十屆全國化學生物學學術會議報告摘要集（青年科學家論壇）[C];2017年

2 居玲莎;李仁奇;楊建軍;徐建國;;DNA甲基化修飾在學習記憶中的作用[A];中國中西醫(yī)結合麻醉學會[CSIA]年會暨第二屆全國中西醫(yī)結合麻醉學術研討會、江蘇省中西醫(yī)結合學會麻醉專業(yè)委員會成立大會論文匯編[C];2015年

3 楊運桂;;RNA Methylations:Regulations and Mechanisms[A];第九屆全國核糖核酸學術討論會論文集[C];2016年

4 何志妮;李道傳;李妙;張波;肖勇梅;陳雯;;FLT1高甲基化修飾可作為多環(huán)芳烴職業(yè)暴露監(jiān)測的生物標志物[A];中國毒理學會第七次全國毒理學大會暨第八屆湖北科技論壇論文集[C];2015年

5 金帆;;ART出生子代DNA穩(wěn)定性及其甲基化修飾改變[A];2014浙江省醫(yī)學會醫(yī)學遺傳學學術年會論文匯編[C];2014年

6 陳豐;章莉莉;萬佳佳;韓倩倩;段文秀;吳疆;葛玉舒;劉丹;;針對組蛋白甲基化修飾基因編碼FRET熒光探針的開發(fā)與應用[A];第十屆全國化學生物學學術會議論文摘要集（墻報）[C];2017年

7 劉建釗;;生物大分子信使RNA m~6A甲基化修飾特異性的研究[A];中國化學會2017全國高分子學術論文報告會摘要集——主題B：生物大分子[C];2017年

8 周雅川;萬冕;李飛飛;樊怡;周昕;杜瑋;皮彩霞;崔迪新;張斌鵬;孫建勛;鄭黎薇;周學東;;組蛋白甲基化修飾調控WNT5A基因在牙間充質細胞分化中的作用機制[A];2017全國口腔生物醫(yī)學學術年會論文匯編[C];2017年

9 陳國強;李智立;;基于MALDI-MS的峰標簽策略:一種能篩選并區(qū)分蛋白質天冬氨酸和谷氨酸體外甲基化修飾的方法[A];第十一次中國生物物理學術大會暨第九屆全國會員代表大會摘要集[C];2009年

10 何志妮;李道傳;陳麗萍;馬璐;張愛華;段化偉;鄭玉新;肖勇梅;陳雯;;不同環(huán)境暴露人群外周血淋巴細胞TRIM36基因甲基化修飾的特點和意義[A];2017環(huán)境與公共健康學術會議暨中國環(huán)境科學學會環(huán)境醫(yī)學與健康分會、中國毒理學會生化與分子毒理專業(yè)委員會2017年年會論文集[C];2017年

相關重要報紙文章 前5條

1 記者 孫國根;觸發(fā)白血病關鍵蛋白工作機制被揭示[N];健康報;2014年

2 孫國根;白血病發(fā)生關鍵蛋白工作新機制被發(fā)現(xiàn)[N];中國醫(yī)藥報;2014年

3 本報特約撰稿 王丹紅;20年磨一劍 打開DNA研究新天地[N];四川科技報;2007年

4 生命學院;楊茂君研究組在《基因與發(fā)育》上發(fā)文[N];新清華;2014年

5 記者 李鵬;孿生兇手,殺死DNA檢測？[N];北京科技報;2012年

相關博士學位論文 前10條

1 劉曉丹;m_2~6A雙甲基化修飾及其甲基化機理的結構和功能研究[D];中國科學技術大學;2019年

2 王晨;靶向蛋白精氨酸甲基轉移酶的藥物發(fā)現(xiàn)、優(yōu)化與抗腫瘤機制研究[D];中國科學院大學(中國科學院上海藥物研究所);2019年

3 黨艷麗;宮頸癌DAP-kinase1基因異常甲基化修飾及其逆轉的研究[D];第四軍醫(yī)大學;2004年

4 江凌慧;膿毒癥患者外周血白細胞中組蛋白甲基化修飾的研究[D];復旦大學;2013年

5 李靜;H3K4二甲基化修飾結合蛋白的鑒定及其功能研究[D];華東師范大學;2011年

6 耿鵬宇;精氨酸甲基轉移酶PRMT7的自甲基化修飾及其在乳腺癌進程中的作用和機制研究[D];東北師范大學;2017年

7 潘煒松;PRMT1通過對MyoD精氨酸甲基化修飾調控成肌細胞分化[D];北京協(xié)和醫(yī)學院;2010年

8 王居平;TLR4乙�；�/甲基化修飾激活對炎癥免疫的調節(jié)[D];浙江大學;2011年

9 陳國強;20S蛋白酶體快速分離和異質性研究及蛋白質體外甲基化修飾和行為表征[D];中國協(xié)和醫(yī)科大學;2010年

10 嚴忠海;DNA甲基化修飾與內源性miRNA對珠蛋白基因表達調控的研究[D];上海交通大學;2008年

相關碩士學位論文 前10條

1 方仲佩;基于核磁共振的兩種甲基化修飾蛋白檢測[D];中國科學院大學(中國科學院武漢物理與數學研究所);2019年

2 王緋緋;轉錄因子YY2的賴氨酸甲基化修飾的功能和分子機制研究[D];廈門大學;2018年

3 陶雪蓮;豬肌肉和脂肪組織全轉錄組m~6A甲基化圖譜揭示轉錄調控功能及差異甲基化修飾模式[D];四川農業(yè)大學;2017年

4 廖光紅;H3K4甲基化酶SET1A甲基化修飾YAP的機制和生物學功能的研究[D];華東師范大學;2016年

5 麻玉慧;WDR5賴氨酸甲基化修飾及其功能研究[D];東北師范大學;2016年

6 關文月;細胞特異性的DNMT1甲基化修飾對其穩(wěn)定性的調控[D];華東師范大學;2012年

7 韓化南;組蛋白精氨酸甲基化修飾調控擬南芥芽再生的機制研究[D];山東農業(yè)大學;2013年

8 普雪嬌;甲基化修飾和位點突變分別對擬南芥SEC24蛋白功能的影響[D];深圳大學;2016年

9 任慶先;膠質瘤細胞中GDNF基因啟動子1區(qū)甲基化修飾對其基因轉錄的影響[D];蘇州大學;2012年

10 倪東京;組蛋白甲基化修飾在HBV誘導肝細胞基因表達改變中的作用機制研究[D];第三軍醫(yī)大學;2014年

本文編號：2682317