本文關鍵詞：Peroxiredoxin-1在胃癌腹膜轉移中的作用及相關機制的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：【背景】胃癌是我國目前最常見惡性腫瘤之。腹膜轉移是其最常見的轉移形式，同時也是胃癌根治術后最常見的復發(fā)形式，是影響胃癌治療效果的關鍵因素之【1-2】，也是導致胃癌患者死亡的主要原因之【3】。目前，胃癌腹膜轉移的機制尚不清楚，研究表明可能與多個癌基因、抑癌基因以及氧化還原狀態(tài)等有關【4】。近年來，隨著胃癌根治術的開展與成熟，其局部復發(fā)率有所下降，但是其死亡率任然居于各種惡性腫瘤死亡率的前列。相關統計表明：約25%的胃癌患者在術前或者術中被診斷存在胃癌的腹膜轉移，從而失去了手術治療的最佳機會，進展期胃癌即使行胃癌根治術治療，術后任然有大約40%-60%的患者會發(fā)生腹膜轉移。因此，有必要對胃癌腹膜轉移的相關因素進行深入研究以揭示其發(fā)生和發(fā)展的機制，進而有效地指導臨床治療和改善預后。 Peroxiredoxin-1(Prx-1)是新近發(fā)現的類抗氧化物酶Peroxiredoxins家族中的種。以往對Prx-1的研究主要是其在抗氧化方面的作用，表現為Prx-1對活性氧族（activated oxygen species,AOS）的清除，保護細胞免受活性氧造成的損傷。近年來的研究發(fā)現：Prx-1與多種腫瘤細胞的增殖，分化和轉移等生物學行為密切相關。研究表明：Prx-1在多種腫瘤中高表達，而抑制Prx-1的表達，可導致腫瘤增殖受抑和放療增敏作用，因此，初步推斷Prx-1與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關。但Prx-1與人類胃癌的腹膜轉移是否相關目前尚不清楚。 通過比較蛋白組學對胃癌細胞系（SGC823）和腹膜高轉移潛能的胃癌細胞系(SGC7901)進行比較，尋找兩種細胞系之間的差異蛋白。研究發(fā)現：Prx-1為兩種細胞系之間的差異蛋白之，在腹膜高轉移潛能胃癌細胞系(SGC7901)中表達上調。進步通過Western blot免疫印記法和免疫組化法在細胞水平和臨床標本水平進行檢驗，實驗結果表明：較胃癌細胞系(SGC823)，腹膜高轉移潛能的胃癌細胞系(SGC7901)中Prx-1的表達顯著增強；胃癌腹膜轉移灶與癌旁正常組織、胃癌原發(fā)灶、淋巴結轉移灶兩兩比較，其陽性率結果有差異。因此，初步推斷，Prx-1在胃癌的腹膜轉移中可能發(fā)揮重要作用。 【目的】 1、應用比較蛋白組學尋找胃癌細胞系(SGC823)和腹膜高轉移潛能胃癌細胞系(SGC7901)之間的差異性蛋白。 2、檢驗胃癌細胞系（SGC823）和腹膜高轉移潛能胃癌細胞系(SGC7901)中Prx-1的表達情況。 3、研究Prx-1在人類胃癌腹膜轉移灶中的表達情況，，比較Prx-1在胃癌原發(fā)灶，胃癌腹膜轉移灶，淋巴結轉移灶及癌旁正常胃黏膜組織中的表達情況，探究Prx-1在人類胃癌腹膜轉移中的機制及其與患者病理參數之間的關系。 【方法】 1、細胞總蛋白的制備和雙向電泳： 胃癌細胞系(BGC823)和腹膜高轉移潛能胃癌細胞系(SGC7901)在溫度37℃、CO2濃度5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時，取對數生長期細胞制備總蛋白；用Bradford法檢測蛋白質濃度；用提取400ug細胞總蛋白行雙向電泳；用24cm、PH值為4-7、固相PH梯度（IPG）膠條泡脹上樣。 2.電泳凝膠圖像分析： 銀染后的電泳凝膠采用ImageScanner圖像掃描儀和Imagemaster圖像分析軟件進行掃描和分析。同等條件下，對兩個細胞系的總蛋白樣品進行3次雙向電泳和圖像分析，在同種細胞系的蛋白質電泳圖譜中挑選蛋白質點清晰的圖像作為參照，與另外兩次的電泳圖像進行匹配。最后將3次電泳所得的蛋白質點圖譜在Imagemaster軟件中創(chuàng)建平均膠。以（BGC823）細胞系的平均膠為參照膠與（SGC7901）細胞系的平均膠行兩兩匹配比較。以蛋白質表達水平（相對體積）增加2倍及2倍以上作為差異點，并把這些點從凝膠中切割下來進步分析。 3、蛋白質質譜分析： 取雙向電泳凝膠上表達差異的蛋白質點凝膠塊進行膠內酶切，并提取肽段。取α-氰基-4-基肉桂酸（α-CHCA）5mg/ml的基質溶解液0.5ul加入到金屬樣品板點樣孔內，然后加入含有0.1%三氟乙酸（TFA）的水-乙腈混合液0.5ul溶解肽段提取物。在室溫下干燥樣本。用基質輔助激光解析離子化飛行時間串聯質譜儀4700型分析肽質量指紋圖譜和串聯質譜（MS/MS）。每個點樣孔每種光譜激光發(fā)射500次，收集相對分子質量/電荷比值（質荷比）為800-3200的峰譜。然后選取定數量的肽段進行碰撞誘導解離（CID）串聯質譜分析，激光頻率為200Hz。 4、Western blot蛋白印跡（1）： 將準備好的細胞用4℃預冷PBS液洗滌，重復3次，將PBS棄盡。每瓶細胞加入400μ l含PMSF的裂解液，在冰上裂解30分鐘。裂解完成后，用刮棒將細胞刮于培養(yǎng)瓶側，用槍將細胞碎片和裂解液移至1.5ml離心管內。離心后提取上清，Bradford法蛋白定量。樣品上樣于12％PAGE—SDS電泳后轉至NC膜上。加入抗室溫雜交3小時后加入HRP標記的二抗作用，最后加入熒光劑暗室曝光顯影。 5、采用免疫組化SP法： 4μ m石蠟切片，常規(guī)脫蠟至水，PBS（PH7.4）洗滌3次，高壓鍋內煮沸8分鐘修復抗原；3%H2O2孵育10分鐘以消除內源性過氧化物酶活性。正常山羊血清封閉非特異性抗原10分鐘，傾去血清，滴加Prx-1單抗，4℃條件下放置過夜。滴加二抗室溫孵育30分鐘，PBS洗滌3次，DAB顯色；蘇木精復染；中性樹脂封片。 7、數據分析： 應用GPS Explore軟件處理肽質量指紋圖譜和串聯質譜數據，在搜索引擎（Http://www.matrixscience.com）上進行數據解析，使用的數據庫為NCBInr蛋白質數據庫。搜索條件如下：數據分析類型為MS聯合MS/MS；搜索物種為人；肽質量偏差范圍為2000；串聯質譜偏差范圍為4000。對數據庫搜索的結果根據蛋白評分、總離子評分、序列覆蓋率及直接測序等進行綜合評價，從而鑒定出蛋白質（每個差異表達蛋白質點鑒定出個蛋白質），并計算出可信度。 【結果】 1、雙向凝膠電泳分析和質譜分析鑒定結果：通過2-DE PAGE分離技術發(fā)現，(BGC823)圖譜平均檢測到(1130+60)個蛋白點，(SGC7901)圖譜平均檢測到(1030+53)個蛋白點。進行兩組問的匹配分析，篩選出大于或等于兩例以上的顯著差異點有30個。使用Mascot軟件搜索NCBI蛋白質序列數據庫后，進行綜合分析，共成功鑒定出20個有意義的蛋白質。11個蛋白僅在SCG7901細胞株表達明顯增高，同時我們發(fā)現9個蛋白僅BGC823中高表達，其中Prx-1在SCG7901中表達增高。 2、Western blot蛋白印跡研究結果表明，胃癌細胞系（BGC823）和腹膜高轉移潛能細胞系（SGC7901）中Prx-1的表達呈差異性，Prx-1在(SCG7901）中表達明顯增高，覆蓋率達64%。 3、免疫組化結果顯示:胃癌原發(fā)灶，腹膜轉移灶，淋巴結轉移灶和癌旁正常胃黏膜組織中Prx-1的陽性率比較，差異有統計學意義，總的卡方值為61.038，(P0.01);腹膜，轉移灶和胃癌原發(fā)灶，淋巴結轉移灶，癌旁正常胃黏膜行兩兩比較，應用卡方分割法，差異有統計學意義(P0.017)。 【結論】： 我們的研究結果表明Prx-1與胃癌的腹膜轉移可能相關，Prx-l可能是胃癌腹膜轉移的個分子標記物和預后指標，但是其內在機理尚需進步研究。
【關鍵詞】：胃癌 胃癌腹膜轉移 Prx-1
【學位授予單位】：山西醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R735.2
【目錄】：

• 中英文縮略詞5-6
• 摘要6-10
• Abstract10-12
• 前言12-13
• 材料與方法13-20
• 結果20-24
• 討論24-27
• 參考文獻27-29
• 綜述29-34
• 綜述參考文獻32-34
• 致謝34-35
• 個人簡歷35

【參考文獻】

中國期刊全文數據庫 前3條

1 曾躍平;劉潔;王寶璽;;過氧化物酶Peroxiredoxin家族與腫瘤關系研究進展[J];癌癥進展;2010年02期

2 章波,向渝梅,白云;抗氧化蛋白Peroxiredoxin家族研究進展[J];生理科學進展;2004年04期

3 李正榮;詹文華;;胃癌腹膜轉移的治療進展[J];中華胃腸外科雜志;2006年05期

  本文關鍵詞：Peroxiredoxin-1在胃癌腹膜轉移中的作用及相關機制的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：413306