【摘要】：人牙齦成纖維細(xì)胞(human gingival fibroblasts,HGFs)是牙齦組織中主要的感受性細(xì)胞和效應(yīng)性細(xì)胞,體外HGFs的形成及功能會(huì)受機(jī)械性應(yīng)力的影響,生物學(xué)行為的變化及變化機(jī)制尚不明確。既往研究?jī)H從單一分子或基因水平上對(duì)HGFs的分子生物學(xué)機(jī)制進(jìn)行研究,無(wú)法從整體、動(dòng)態(tài)層面了解HGFs在機(jī)械性應(yīng)力作用下相關(guān)調(diào)控基因和功能蛋白產(chǎn)物的變化規(guī)律。蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法的成熟應(yīng)用,為我們研究HGFs生物學(xué)行為的變化機(jī)制提供了新的技術(shù)手段和研究思路。 本研究采用四點(diǎn)彎曲細(xì)胞應(yīng)力加載系統(tǒng),對(duì)體外培養(yǎng)的HGFs細(xì)胞系加載2000μ strain周期性單軸壓應(yīng)力,作用時(shí)間分別為3h,6h,12h及24h,采用免疫細(xì)胞化學(xué)、CCK-8、BCA法蛋白定量分析、蛋白質(zhì)雙向電泳、生物質(zhì)譜等方法檢測(cè)周期性單軸壓應(yīng)力對(duì)HGFs細(xì)胞增殖活性的影響,尋找出HGFs增殖活性最高的壓應(yīng)力加載時(shí)相,同時(shí)進(jìn)行蛋白質(zhì)雙向凝膠電泳分析,發(fā)現(xiàn)差異蛋白質(zhì)點(diǎn)并對(duì)其進(jìn)行質(zhì)譜鑒定。 研究?jī)?nèi)容如下： 1.周期性單軸壓應(yīng)力對(duì)HGFs增殖能力的影響 目的：研究周期性單軸壓應(yīng)力對(duì)HGFs增殖能力的影響。 方法：體外成功培養(yǎng)HGFs細(xì)胞系,采用四點(diǎn)彎曲細(xì)胞應(yīng)力加載系統(tǒng),分別在不同的刺激時(shí)相((3h,6h,12h,24h),用2000μ strain大小的應(yīng)力對(duì)HGFs進(jìn)行加力。采用CCK-8法檢測(cè)周期性單軸壓應(yīng)力對(duì)HGFs增殖能力的影響。 結(jié)果：2000μ strain周期性單軸壓應(yīng)力作用3h后,人牙齦成纖維細(xì)胞增殖能力沒(méi)有明顯變化,但隨著時(shí)間的延長(zhǎng),6h細(xì)胞的增殖活性逐步加強(qiáng)(P0.05),12h壓應(yīng)力刺激后HGFs光密度值(0D)最高,達(dá)到為0.701±0.035,提示HGFs進(jìn)入增殖高峰(P0.01)。 結(jié)論：2000μ strain周期性單軸壓應(yīng)力加載12h后,HGFs增殖能力達(dá)到最大。 2.周期性單軸壓應(yīng)力刺激HGFs后差異蛋白質(zhì)的質(zhì)譜分析 目的：研究周期性單軸壓應(yīng)力刺激HGFs后蛋白質(zhì)雙向凝膠電泳表達(dá)的差異。獲得差異蛋白質(zhì)點(diǎn)的肽質(zhì)量指紋圖譜,進(jìn)行質(zhì)譜鑒定,根據(jù)鑒定結(jié)果推測(cè)HGFs受到機(jī)械壓應(yīng)力后這些差異蛋白質(zhì)發(fā)揮的生物學(xué)作用。 方法：采用四點(diǎn)彎曲細(xì)胞應(yīng)力加載系統(tǒng),根據(jù)實(shí)驗(yàn)1結(jié)果,選擇2000μ strain大小的壓應(yīng)力加載12h的HGFs為加力組,以正常細(xì)胞作為靜態(tài)組。分別對(duì)加力組和靜態(tài)組的細(xì)胞進(jìn)行裂解、BCA法蛋白質(zhì)定量檢測(cè),蛋白質(zhì)雙向凝膠電泳,凝膠硝酸銀染色,應(yīng)用凝膠分析軟件ImageMaster2D對(duì)蛋白質(zhì)點(diǎn)進(jìn)行分析。此外,對(duì)差異蛋白質(zhì)點(diǎn)進(jìn)行原位酶解后制備樣品,脫鹽,使用MALDI-TOF質(zhì)譜儀進(jìn)行分析,將獲得的蛋白質(zhì)肽質(zhì)量指紋譜數(shù)據(jù)通過(guò)Mascot搜索引擎在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行檢索,并確定出蛋白質(zhì)的各種信息。 結(jié)果：加力組和靜態(tài)組分別得到607±15和586±19個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)。總蛋白質(zhì)點(diǎn)在HGFs受到壓應(yīng)力后顯著增加。經(jīng)MALDI-TOF質(zhì)譜儀分析,獲得了7個(gè)差異蛋白的肽質(zhì)量指紋圖譜,蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)檢索,成功鑒定出α-烯醇化酶、核糖體再循環(huán)因子、波形蛋白、α2-巨球蛋白、泛素羥基末端水解酶、延伸因子1、透明質(zhì)酸酶7個(gè)差異蛋白質(zhì)。按照功能分類,大致與以下生物活動(dòng)相關(guān)：應(yīng)激反應(yīng),能量代謝,細(xì)胞增殖,細(xì)胞骨架重建,信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。 結(jié)論：1.通過(guò)蛋白質(zhì)雙向凝膠電泳技術(shù)結(jié)合硝酸銀染色,可以得到HGFs加載壓應(yīng)力后分辨率較高、可重復(fù)性較好的差異蛋白質(zhì)譜,為進(jìn)一步進(jìn)行質(zhì)譜鑒定奠定了良好的基礎(chǔ)；2.通過(guò)差異蛋白質(zhì)組學(xué)研究,發(fā)現(xiàn)了周期性單軸壓應(yīng)力作用下,調(diào)控HGFs生物學(xué)行為的7個(gè)有意義的關(guān)鍵蛋白質(zhì),并推測(cè)了這些蛋白質(zhì)在牙齦組織改建中的作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：廣西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R783.5

【參考文獻(xiàn)】

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