本文選題：旋毛蟲幼蟲　切入點(diǎn)：侵入　出處：《鄭州大學(xué)》2012年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：旋毛形線蟲[Trichinella spiralis (Owen,1835) Railliet,1895],簡稱旋毛蟲,是一種成蟲和幼蟲分別寄生在同一宿主的小腸和骨骼肌細(xì)胞內(nèi)的線蟲。旋毛蟲引起的旋毛蟲病(trichinellosis)是一種危害非常嚴(yán)重的食源性人獸共患寄生蟲病。當(dāng)人或動(dòng)物生食或半生食含旋毛蟲的肉類后,幼蟲在胃液的作用下被消化脫囊釋放出來,迅速進(jìn)入小腸中的多細(xì)胞內(nèi)龕中。在感染性第一期幼蟲鉆入腸道柱狀上皮細(xì)胞內(nèi)龕后,稱之為旋毛蟲腸道感染性第一期幼蟲(L1)；經(jīng)29-36h完成4次蛻皮(L1-L4)后發(fā)育為成蟲,雌雄交配,96h后產(chǎn)出新生幼蟲,新生幼蟲經(jīng)血循環(huán)移行到肌肉組織,幼蟲在肌肉中可以生存數(shù)年而保持感染性。因此,脫囊幼蟲(腸道感染性第1期幼蟲)侵入腸粘膜內(nèi)繼續(xù)發(fā)育或是被宿主從腸道排出,是旋毛蟲能否導(dǎo)致宿主感染與致病的關(guān)鍵步驟。 盡管旋毛蟲侵入腸上皮細(xì)胞的體外模型已建立,但是感染性幼蟲對(duì)腸上皮細(xì)胞的識(shí)別,侵入和移行的機(jī)制均不完全清楚。本研究模擬旋毛蟲感染宿主的環(huán)境,將感染性幼蟲與小腸上皮細(xì)胞在體外共培養(yǎng),對(duì)培養(yǎng)前后的蟲體蛋白和細(xì)胞蛋白進(jìn)行SDS-PAGE分離,聯(lián)合Western blot挑選出有差異的條帶,采用shotgun液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜系統(tǒng)進(jìn)行鑒定,將質(zhì)譜分析得到的數(shù)據(jù)應(yīng)用SEQUEST軟件及數(shù)據(jù)庫搜索完成蛋白質(zhì)的鑒定,檢測旋毛蟲感染性幼蟲在侵入小腸上皮細(xì)胞前后蟲體蛋白和細(xì)胞蛋白的變化,并對(duì)鑒定出的蛋白質(zhì)從分子功能、生物學(xué)途徑、亞細(xì)胞定位三個(gè)方面進(jìn)行GOA分類。幼蟲與細(xì)胞接觸后早期表達(dá)的蛋白可能是其侵入的相關(guān)蛋白,幼蟲早期表達(dá)的蛋白抗原對(duì)本病的早期診斷也可能具有重要價(jià)值。這些研究將為更深入了解旋毛蟲侵入腸上皮細(xì)胞機(jī)制提供有力的數(shù)據(jù)支持和參考。 材料與方法 1.旋毛蟲蟲種、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及細(xì)胞系本實(shí)驗(yàn)所用的旋毛蟲為河南省南陽豬源旋毛蟲(Trichinella spiralis),由本室昆明小鼠傳代保種。20只雄性6周齡昆明小鼠(清潔級(jí)),體重20g-25g,均購自鄭州大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。人回盲腸癌細(xì)胞HCT-8[HRT-18]購于中國科學(xué)院細(xì)胞庫。 2.旋毛蟲肌幼蟲的收集與激活將旋毛蟲肌幼蟲按照300條/只經(jīng)口感染50只昆明小鼠,42 d后脫頸椎處死。膈肌壓片鏡檢證實(shí)感染成功后,剝皮、除內(nèi)臟和脂肪,用攪拌器攪碎至肌肉完全攪碎。采用人工消化法消化4 h,按貝氏法收集肌幼蟲。將收集的肌幼蟲用含5%人膽汁的PBS在37℃5%C02條件下孵育2-3 h,用PBS洗滌3次后,加入含抗生素的PBS中37℃孵育1h備用。 3.細(xì)胞培養(yǎng)將HCT-8細(xì)胞接種在RPMI-1640完全培養(yǎng)基中,在37℃5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng),2-3 d即可形成致密的單細(xì)胞層,此時(shí)用于接種肌幼蟲。在接種前1d按照常規(guī)方法給細(xì)胞換液,以及時(shí)去除死細(xì)胞,保證細(xì)胞狀態(tài)良好。 4.旋毛蟲蟲體蛋白和HCT-8細(xì)胞蛋白的SDS-PAGE分析及Western blot鑒定將激活的肌幼蟲與RPMI-1640培養(yǎng)基按5000條/ml的比例混合后加入長滿HCT-8細(xì)胞的75m1培養(yǎng)瓶中,37℃5%CO2條件下培養(yǎng)18h后,去除培養(yǎng)基與幼蟲,收集肌幼蟲,加入0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA消化后收集細(xì)胞,按比例分別加入RIPA裂解液提取蟲體蛋白和細(xì)胞蛋白。BCA法測得蟲體蛋白和細(xì)胞蛋白后,利用SDS-PAGE及蛋白質(zhì)印跡(Western blot)進(jìn)行分析。 5. LC-MS/MS分析根據(jù)Western blot的結(jié)果,比對(duì)膠上相匹配的差異條帶。用手術(shù)刀片將膠上差異部分切割下來,胰酶酶解、抽提肽段,酶解后得到的肽段提取物使用LC-MS/MS系統(tǒng)進(jìn)行分析,質(zhì)譜設(shè)備為Finnigan線性離子阱串聯(lián)質(zhì)潛儀LTQ.microspray模式。質(zhì)譜儀配置C-18反相色譜柱,流動(dòng)相A相為0.1%溶于超純水的甲酸,B相為0.1%溶于乙睛水溶液中的甲酸。肽段混合物的洗脫梯度：2%～80%,洗脫時(shí)間60min,重復(fù)三次。串聯(lián)質(zhì)譜分析包括一個(gè)全掃描(fullMS scan)和十個(gè)串聯(lián)掃描(MS/MS scan)。 6.質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析和處理數(shù)據(jù)搜索引擎為Bioworks version3.2 software(SEQUSET, Thermo Electron)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)庫搜索。肽段數(shù)據(jù)經(jīng)SEQUEST過濾、匹配,只有分值較高的肽段被保留。過濾參數(shù)為：當(dāng)Charge+1, Xcorr≥1.9;當(dāng)Charge+2, Xcorr≥2.2;當(dāng)Charge+3, Xcorr≥3.75;其中DelCN≥0.1。最后得到胰酶消化的蛋白質(zhì)信息列表數(shù)據(jù)。 7. InterPro注解和GO分類使用EXPASY工具在線分析蛋白質(zhì)的基本理化性質(zhì)(包括分子量Mr、等電點(diǎn)pI等),最后用圖表進(jìn)行展示。使用InterProscan軟件完成對(duì)蛋白序列的搜索。采用GO工具,從生物學(xué)途徑、亞細(xì)胞定位及分子功能三方面對(duì)蛋白質(zhì)表達(dá)譜進(jìn)行功能分析及分類,并通過WEGO在線分析展示各部分分布。 結(jié)果 1.幼蟲與HCT-8細(xì)胞培養(yǎng)后蟲體蛋白的SDS-PAGE與Western blot分析SDS-PAGE結(jié)果表明,在培養(yǎng)基中培養(yǎng)18h的蟲體抗原有41條蛋白帶。HCT-8細(xì)胞與幼蟲培養(yǎng)后的蟲體蛋白增加了9條蛋白帶(15、29、31、35、37、58、69、121和132 kDa),減少了4條蛋白帶(12、17、40、51 kDa)。Western blot結(jié)果顯示,幼蟲在培養(yǎng)基中孵育18h后蟲體蛋白能夠被旋毛蟲感染鼠血清識(shí)別的有18條帶,分子量范圍為18 kDa-135 kDa,幼蟲和HCT-8細(xì)胞孵育后與僅在培養(yǎng)基中孵育的幼蟲相比,被旋毛蟲感染鼠血清多識(shí)別了7條蛋白帶(21、28、30、36、58、77和123 kDa),少識(shí)別了3條蛋白帶(23、51、97 kDa)。 2.LC-MS/MS分析和鑒定旋毛蟲幼蟲蛋白旋毛蟲感染性幼蟲和HCT-8細(xì)胞共孵育后,被感染旋毛蟲鼠血清識(shí)別的3條蛋白帶被從膠上切離下來,分子量分別為21、36及58 kDa。應(yīng)用shotgun LC-MS/MS和生物信息學(xué)分析,共有211個(gè)非冗余蛋白質(zhì)被鑒定出來。在高可信度蛋白質(zhì)當(dāng)中,有67.8%的蛋白相對(duì)分子量范圍為20 kDa～65 kDa。對(duì)于等電點(diǎn)來說,有123種(58.3%)蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)范圍為4～7,58種(28.9%)蛋白的等電點(diǎn)范圍為8～10。少于8.5%的蛋白等電點(diǎn)范圍為7～8,10種(3.8%)蛋白質(zhì)具有較高的等電點(diǎn)(大于10)。 3.旋毛蟲幼蟲蛋白根據(jù)GO進(jìn)行功能分類對(duì)鑒定出的旋毛蟲的211種蛋白,利用GO工具,從生物學(xué)過程、分子功能和細(xì)胞定位三個(gè)方面進(jìn)行分類。旋毛蟲蛋白的分子功能共分為10大類,其中催化活性(75種蛋白,17.5%)和蛋白結(jié)合(110種蛋白,25.6%)是兩大主要功能。大部分的細(xì)胞和代謝過程與大分子的合成和降解有關(guān),尤其是糖類,核苷酸和蛋白可能是感染性幼蟲在發(fā)育和生長過程中釋放出來的。在211種蛋白中,139種蛋白位于細(xì)胞中,105種位于細(xì)胞器中。 4.HCT-8細(xì)胞與幼蟲培養(yǎng)后細(xì)胞蛋白的SDS-PAGE與Western blot分析SDS-PAGE結(jié)果表明,正常的HCT-8細(xì)胞有44條蛋白帶。HCT-8細(xì)胞與幼蟲培養(yǎng)后的細(xì)胞蛋白與正常HCT-8細(xì)胞蛋白相比增加了5條蛋白帶(19、34、61、128和132 kDa),減少了1條蛋白帶(118 kDa)。Western blot結(jié)果顯示,正常HCT-8細(xì)胞的蛋白能夠被旋毛蟲感染鼠血消識(shí)別的有5條帶,分子量范圍為30～129 kDa; HCT-8細(xì)胞與幼蟲培養(yǎng)后與培養(yǎng)前的HCT-8細(xì)胞相比,被旋毛蟲感染鼠血清多識(shí)別了4條蛋白帶(24、35、61和115 kDa)。 5. LC-MS/MS分析HCT-8細(xì)胞蛋白HCT-8細(xì)胞與幼蟲共孵育后,被旋毛蟲感染鼠血清多識(shí)別的細(xì)胞蛋白的分子量分別為24、35、61 kDa,將這3條蛋白帶通過shotgun LC-MS/MS進(jìn)行進(jìn)一步分析。共有64種非冗余蛋白被鑒定出來。有43種蛋白(67.2%)分子量范圍分布在10～70 kDa。等電點(diǎn)的范圍為4.7～10.92,其中有26種蛋白(40.6%)的等電點(diǎn)在5～6。 6.HCT-8細(xì)胞與幼蟲共孵育后增加的蛋白通過GO進(jìn)行基因分類利用GO工具,64種非冗余蛋白中共有54種蛋白質(zhì)的功能已知。腸上皮細(xì)胞與幼蟲共孵育后細(xì)胞中的旋毛蟲蛋白有注解的與細(xì)胞成分有關(guān)。其中46種蛋白在細(xì)胞中,35種在細(xì)胞器中。根據(jù)GO的分子功能分類,共可分為7大類,其中結(jié)合功能(43,79.6%)和催化活性(23,42.6%)仍然是兩大主要功能。大部分的蛋白參與了生物進(jìn)程,主要是細(xì)胞過程、新陳代謝、生物進(jìn)程的調(diào)控及應(yīng)激和信號(hào)傳導(dǎo)。 結(jié)論 1.旋毛蟲幼蟲與HCT-8細(xì)胞培養(yǎng)后,被感染鼠血清多識(shí)別的7條蟲體蛋白帶(21、28、30、36、58、77和123 kDa)可能是幼蟲與細(xì)胞接觸后分泌的新蛋白；少識(shí)別的3條蛋白帶(23、51、97 kDa)可能是被HCT-8細(xì)胞釋放的蛋白酶水解掉的蟲體蛋白或是蟲體發(fā)育過程中期特異性蛋白的改變。 2.HCT-8細(xì)胞與旋毛蟲幼蟲與培養(yǎng)后,被感染鼠血清多識(shí)別的4條細(xì)胞蛋白帶(24、35、61和115 kDa),可能是進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的蟲體分泌蛋白。 3.對(duì)6條蛋白帶(蟲體蛋白的21、36和58 kDa及細(xì)胞蛋白的24、35和61kDa)應(yīng)用shotgun分別鑒定出了211種和64種旋毛蟲蛋白,初步建立了可能與旋毛蟲侵入腸上皮細(xì)胞有關(guān)的蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫,為旋毛蟲幼蟲侵入蛋白的進(jìn)一步篩選與鑒定奠定了基礎(chǔ)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R383.13

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前4條

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2 王中全,崔晶;旋毛蟲排泄分泌抗原的研究進(jìn)展[J];中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào);2003年02期

3 崔晶,王中全,張燈;旋毛蟲肌幼蟲排泄分泌物中特異性診斷抗原的研究[J];中國寄生蟲學(xué)與寄生蟲病雜志;2003年05期

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本文編號(hào)：1557799