本文關(guān)鍵詞：擬南芥WRKY轉(zhuǎn)錄因子在非生物脅迫響應(yīng)中的功能研究

  更多相關(guān)文章： 干旱 鹽脅迫 鋁毒 種子休眠 氣孔 側(cè)根 轉(zhuǎn)錄因子 WRKY 擬南芥

【摘要】：干旱、鹽脅迫和酸性土壤中的鋁毒害是造成作物減產(chǎn)的主要非生物逆境,而植物響應(yīng)這些脅迫的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)以及分子調(diào)控機(jī)制仍有待進(jìn)一步的研究和拓展。轉(zhuǎn)錄因子在植物信號(hào)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮了極其重要的作用,它們一方面接受被感知的信號(hào)進(jìn)而調(diào)控下游基因的表達(dá),另一方面又能成為一個(gè)節(jié)點(diǎn),協(xié)調(diào)不同信號(hào)途徑之間的相互作用。因此,對(duì)轉(zhuǎn)錄因子逆境響應(yīng)的功能研究是我們從分子水平上認(rèn)識(shí)植物如何適應(yīng)惡劣環(huán)境的重要基礎(chǔ)。WRKY家族是植物最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一,其調(diào)控范圍涵蓋植物生長發(fā)育和逆境響應(yīng)等多種生理活動(dòng)。盡管WRKY蛋白在生物脅迫反應(yīng)中已得到了廣泛的研究,但其在非生物脅迫應(yīng)答中的研究還處于起步階段。本文對(duì)擬南芥(Arabidopsis thaliana)中的33個(gè)WRKY基因進(jìn)行表達(dá)分析,最終篩選到了2個(gè)WRKY (WRKY46和WRKY41)參與快速響應(yīng)過氧化氫和鎘的處理,隨后對(duì)這2個(gè)基因的功能進(jìn)行了系統(tǒng)的研究。主要結(jié)果分為以下四個(gè)方面： 1、WRKY46調(diào)控滲透脅迫響應(yīng)以及光依賴的氣孔運(yùn)動(dòng) 在多種非生物脅迫的處理中,WRKY46對(duì)水分脅迫(干旱、滲透和鹽脅迫)的響應(yīng)尤為明顯。干旱和鹽脅迫在短時(shí)間內(nèi)便可顯著提高WRKY46的轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平。WRKY46T-DNA插入突變體對(duì)干旱和鹽脅迫十分敏感,表現(xiàn)為突變體地上部生長差于野生型。然而,WRKY46過表達(dá)株系在平板處理?xiàng)l件下(封閉的環(huán)境)對(duì)鹽和滲透脅迫有較高的耐性,但在土培條件下(開闊的環(huán)境)卻對(duì)干旱和鹽脅迫非常敏感。原因是WRKY46過表達(dá)植株的葉片具有較高的失水率。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),WRKY46的過表達(dá)可以抑制保衛(wèi)細(xì)胞中ROS (reactive oxygen species)的產(chǎn)生,從而破壞ABA (abscisic acid)誘導(dǎo)的氣孔關(guān)閉過程。另一方面,我們發(fā)現(xiàn)WRKY46受光的誘導(dǎo)表達(dá),并且其在保衛(wèi)細(xì)胞中的表達(dá)不受干旱等處理的影響。WRKY46在保衛(wèi)細(xì)胞中的主要作用可能是參與光依賴的氣孔打開過程。基因芯片分析發(fā)現(xiàn),WRKY46調(diào)控了一系列參與細(xì)胞滲透保護(hù)和氧化還原平衡的基因的表達(dá)。此外,WRKY46也通過調(diào)控QQS (QUA-QUINE STARCH)基因的表達(dá)來調(diào)控保衛(wèi)細(xì)胞中的淀粉代謝,從而調(diào)節(jié)氣孔的打開過程。 因此, WRKY46在脅迫應(yīng)答和氣孔調(diào)控中發(fā)揮了兩種獨(dú)立的作用：一是調(diào)控干旱和鹽脅迫下植物細(xì)胞的滲透保護(hù)和降低氧化脅迫；二是通過調(diào)控保衛(wèi)細(xì)胞中淀粉的代謝來調(diào)節(jié)氣孔的打開。 2、WRKY46調(diào)控鹽和滲透脅迫下的側(cè)根發(fā)育 組織定位分析表明,WRKY46在側(cè)根發(fā)育初期的根原基以及成熟側(cè)根的中柱中表達(dá)。WRKY46的功能缺失導(dǎo)致植株在鹽和滲透脅迫下的側(cè)根發(fā)育受到明顯的抑制(相對(duì)于野生型)。相反,WRKY46的過表達(dá)能夠增強(qiáng)植株在脅迫下的側(cè)根發(fā)育。外源添加生長素可以極大地回復(fù)wrky46突變體在脅迫下的側(cè)根表型,而生長素極性運(yùn)輸抑制劑(TIBA)同時(shí)抑制野生型和WRKY46過表達(dá)植株在脅迫下的側(cè)根發(fā)育,說明WRKY46對(duì)側(cè)根的調(diào)控依賴生長素。對(duì)WRKY46的表達(dá)模式分析發(fā)現(xiàn),WRKY46在根中的表達(dá)受到ABA的顯著抑制,但同時(shí)在鹽或滲透脅迫下,WRKY46也受到ABA以外的信號(hào)調(diào)控。DR5:GUS在wrky46突變體中的表達(dá)明顯低于在野生型中的表達(dá)。與此吻合的是,突變體根中游離IAA的含量出現(xiàn)降低,而橋連IAA的含量有所提高(相對(duì)于野生型)；而WRKY46過表達(dá)株系的IAA含量變化與突變體正好相反�；虮磉_(dá)分析發(fā)現(xiàn),WRKY46在鹽或滲透脅迫下調(diào)控ABI4(ABA INSENSITIVE4)和參與生長素橋連的相關(guān)基因的表達(dá)。染色質(zhì)免疫共沉淀進(jìn)一步證實(shí)WRKY46可以直接結(jié)合到這些基因的啟動(dòng)子上。以上結(jié)果證明,WRKY46通過調(diào)控ABA信號(hào)途徑和生長素內(nèi)穩(wěn)態(tài)進(jìn)而參與前饋抑制鹽或滲透脅迫對(duì)植物側(cè)根的抑制。 3. WRKY46調(diào)控鋁誘導(dǎo)的蘋果酸分泌 ALMT1編碼蘋果酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,是擬南芥一關(guān)鍵耐鋁基因。我們發(fā)現(xiàn)在基因芯片中,ALMT1的表達(dá)明顯受到WRKY46的抑制。在鋁處理?xiàng)l件下,WRKY46的表達(dá)在處理3小時(shí)后出現(xiàn)顯著的下調(diào),而ALMT1的表達(dá)受鋁處理的誘導(dǎo)。而且在組織表達(dá)上,WRKY46和ALMT1在擬南芥根中存在共同的表達(dá)區(qū)域,即兩者均在根的中柱表達(dá),說明兩者可能存在調(diào)控關(guān)系。表型分析發(fā)現(xiàn),wrky46突變體在鋁處理下表現(xiàn)出較高的鋁耐性(相對(duì)于野生型),并且突變體含有較低的根系鋁含量。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn),ALMT1在wrky46突變體中的表達(dá)明顯提高,從而增強(qiáng)突變體根系蘋果酸的分泌,緩解鋁毒。煙草中的瞬時(shí)表達(dá)實(shí)驗(yàn)表明,WRKY46可以抑制ALMT1的表達(dá)。利用酵母單雜和染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)進(jìn)一步證實(shí),WRKY46可以直接結(jié)合到ALMT1啟動(dòng)子中的W-box上。以上結(jié)果證明,WRKY46是關(guān)鍵耐鋁基因ALMT1的負(fù)調(diào)控因子,WRKY46的功能缺失提高根系蘋果的分泌,從而降低根系的鋁含量,提高植株對(duì)鋁的耐性。 4、WRKY41調(diào)控種子休眠 盡管WRKY41也能快速響應(yīng)過氧化氫和鹽脅迫的誘導(dǎo),但WRKY41的功能缺失突變體wrky41對(duì)這些處理的響應(yīng)與野生型無明顯差異。研究發(fā)現(xiàn),WRKY41主要在種子中表達(dá)。WRKY41的功能缺失導(dǎo)致種子的初生休眠和熱脅迫下產(chǎn)生的次生休眠都顯著降低,并且wrky41的種子萌發(fā)和幼苗生長對(duì)ABA不敏感。而這種表型與ABI3(ABA INSENSITIVE3)的功能缺失十分相似。基因表達(dá)分析發(fā)現(xiàn),WRKY41的缺失明顯降低ABI3在種子發(fā)育以及萌發(fā)過程中的表達(dá),而過表達(dá)WRKY41可以提高ABI3的表達(dá)。而且,在wrky41中過表達(dá)ABI3可以完全回復(fù)突變體種子休眠相關(guān)的表型。凝膠阻滯和染色質(zhì)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)證明,WRKY41可以直接結(jié)合到ABI3啟動(dòng)子的3個(gè)W-box上。同時(shí)轉(zhuǎn)錄激活實(shí)驗(yàn)表明這些W-box對(duì)ABI3的表達(dá)十分重要。此外,WRKY41不在ABA的下游,并且WRKY41對(duì)ABI3的調(diào)控不依賴于ABA和其它ABI3的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子。但高濃度的ABA可以反饋抑制WRKY41的表達(dá)。最后,對(duì)wrky41aba2雙突變的分析表明,WRKY41和ABA共同調(diào)控ABI3的表達(dá),進(jìn)而調(diào)控種子休眠。
【關(guān)鍵詞】：干旱 鹽脅迫 鋁毒 種子休眠 氣孔 側(cè)根 轉(zhuǎn)錄因子 WRKY 擬南芥
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：Q945
【目錄】：

• 致謝7-8
• 摘要8-11
• Abstract11-15
• 縮略語表15-23
• 第1章 文獻(xiàn)綜述23-39
• 1.1 植物轉(zhuǎn)錄因子概述23-24
• 1.2 WRKY轉(zhuǎn)錄因子24-33
• 1.2.1 WRKY轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)、分類及結(jié)合位點(diǎn)24-27
• 1.2.2 WRKY家族的起源與進(jìn)化27
• 1.2.3 WRKY基因的生物學(xué)功能27-33
• 1.3 ROS33-37
• 1.3.1 ROS的產(chǎn)生33
• 1.3.2 ROS的毒害作用33-34
• 1.3.3 ROS的清除機(jī)制34-35
• 1.3.4 ROS的生物學(xué)功能35-37
• 1.4 問題的提出、擬解決的問題以及技術(shù)路線37-39
• 1.4.1 問題的提出和擬解決的問題37-38
• 1.4.2 技術(shù)路線38-39
• 第2章 WRKY基因響應(yīng)ROS或氧化脅迫39-46
• 2.1 材料和方法39-41
• 2.1.1 植物材料39
• 2.1.2 植物培養(yǎng)及處理?xiàng)l件39
• 2.1.3 基因表達(dá)分析39-41
• 2.2 結(jié)果41-45
• 2.2.1 WRKY基因響應(yīng)過氧化氫41-42
• 2.2.2 WRKY基因響應(yīng)重金屬鎘42-45
• 2.2.3 WRKY基因的時(shí)間表達(dá)分析45
• 2.3 討論45-46
• 第3章 WRKY46調(diào)控?cái)M南芥滲透脅迫響應(yīng)以及光依賴的氣孔運(yùn)動(dòng)46-85
• 3.1 前言46-48
• 3.1.1 干旱和鹽脅迫引發(fā)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)46-47
• 3.1.2 水分脅迫下的轉(zhuǎn)錄調(diào)控47-48
• 3.1.3 光誘導(dǎo)的氣孔運(yùn)動(dòng)48
• 3.2 問題的提出、擬解決的問題以及技術(shù)路線48-50
• 3.2.1 問題的提出和擬解決的問題48-49
• 3.2.2 技術(shù)路線49-50
• 3.3 材料和方法50-60
• 3.3.1 植物材料50
• 3.3.2 植物培養(yǎng)條件50
• 3.3.3 載體構(gòu)建50-52
• 3.3.4 擬南芥轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)52-53
• 3.3.5 T-DNA插入突變體純合株系的PCR鑒定53
• 3.3.6 處理?xiàng)l件53-54
• 3.3.7 葉片失水率測(cè)定54
• 3.3.8 ABA含量測(cè)定54
• 3.3.9 氣孔運(yùn)動(dòng)生理實(shí)驗(yàn)54-55
• 3.3.10 ROS檢測(cè)55
• 3.3.11 MDA含量測(cè)定55
• 3.3.12 GUS染色及活性測(cè)定55-56
• 3.3.13 保衛(wèi)細(xì)胞和葉肉細(xì)胞原生質(zhì)體分離56
• 3.3.14 保衛(wèi)細(xì)胞中淀粉和蘋果酸含量的測(cè)定56-57
• 3.3.15 基因表達(dá)分析57
• 3.3.16 蛋白提取和Western blot測(cè)定57-58
• 3.3.17 染色質(zhì)免疫共沉淀58-60
• 3.4 結(jié)果60-80
• 3.4.1 WRKY46響應(yīng)干旱和鹽脅迫的誘導(dǎo)60-62
• 3.4.2 WRKY46功能缺失突變體對(duì)干旱和鹽脅迫表現(xiàn)敏感62-65
• 3.4.3 WRKY46過表達(dá)株系的表型分析65
• 3.4.4 過表達(dá)WRKY46影響ABA誘導(dǎo)的氣孔關(guān)閉過程65-69
• 3.4.5 WRKY46在保衛(wèi)細(xì)胞中表達(dá)69-71
• 3.4.6 WRKY46參與調(diào)控光誘導(dǎo)的氣孔打開過程71
• 3.4.7 WRKY46調(diào)控細(xì)胞滲透保護(hù)和氧化還原內(nèi)穩(wěn)態(tài)基因的表達(dá)71-77
• 3.4.8 WRKY46調(diào)控保衛(wèi)細(xì)胞的淀粉代謝77-80
• 3.5 討論80-85
• 3.5.1 WRKY46作為早期因子響應(yīng)干旱、鹽以及氧化脅迫80
• 3.5.2 WRKY46參與生物脅迫和非生物脅迫反應(yīng)80-83
• 3.5.3 WRKY46參與氣孔的打開過程83-85
• 第4章 WRKY46調(diào)控鹽和滲透脅迫下擬南芥的側(cè)根發(fā)育85-109
• 4.1 前言85-87
• 4.2 問題的提出、擬解決的問題及技術(shù)路線87-89
• 4.2.1 問題的提出和擬解決的問題87-88
• 4.2.2 技術(shù)路線88-89
• 4.3 材料和方法89-92
• 4.3.1 實(shí)驗(yàn)材料89
• 4.3.2 植物培養(yǎng)條件(同3.3.2)89
• 4.3.3 處理?xiàng)l件89-90
• 4.3.4 T-DNA插入突變體純合株系的PCR鑒定(同3.3.5)90
• 4.3.5 GUS染色(同3.3.12)90
• 4.3.6 IAA含量檢測(cè)90
• 4.3.7 基因表達(dá)分析90
• 4.3.8 染色質(zhì)免疫共沉淀(同3.3.17)90-92
• 4.4 結(jié)果92-105
• 4.4.1 WRKY46在側(cè)根中表達(dá)92-93
• 4.4.2 WRKY46的功能缺失抑制側(cè)根在鹽和滲透脅迫下的發(fā)育93-96
• 4.4.3 生長素回復(fù)wrky46突變體在鹽或滲透脅迫下側(cè)根的生長96
• 4.4.4 過表達(dá)WRKY46促進(jìn)鹽或滲透脅迫下側(cè)根的發(fā)育96
• 4.4.5 生長素、ABA、鹽和滲透脅迫調(diào)控WRKY46的表達(dá)96-100
• 4.4.6 WRKY46影響鹽或滲透脅迫下根中的生長素水平100-101
• 4.4.7 WRKY46調(diào)控鹽或滲透脅迫下ABI4和生長素橋連基因的表達(dá)101-103
• 4.4.8 WRKY46與ABI4和生長素橋連基因啟動(dòng)子體內(nèi)結(jié)合103-105
• 4.5 討論105-109
• 第5章 WRKY46調(diào)控鋁誘導(dǎo)的蘋果酸分泌109-134
• 5.1 前言109-111
• 5.1.1 植物的鋁毒害機(jī)制109-110
• 5.1.2 植物的耐鋁機(jī)制110-111
• 5.2 問題的提出、擬解決的問題及技術(shù)路線111-113
• 5.2.1 問題的提出和擬解決的問題111-112
• 5.2.2 技術(shù)路線112-113
• 5.3 材料和方法113-117
• 5.3.1 植物材料113
• 5.3.2 植物培養(yǎng)條件(同3.3.2)113
• 5.3.3 鋁處理?xiàng)l件113
• 5.3.4 GUS染色和活性測(cè)定(同3.3.12)113
• 5.3.5 根系鋁含量測(cè)定113-114
• 5.3.6 根系有機(jī)酸分泌的測(cè)定114
• 5.3.7 煙草葉片中的瞬時(shí)表達(dá)114-115
• 5.3.8 酵母單雜實(shí)驗(yàn)115
• 5.3.9 基因表達(dá)分析115
• 5.3.10 染色質(zhì)免疫共沉淀115-117
• 5.4 結(jié)果117-130
• 5.4.1 WRKY46響應(yīng)鋁117-120
• 5.4.2 WRKY46的功能缺失提高擬南芥的鋁耐性120
• 5.4.3 WRKY46調(diào)控ALMT1的表達(dá)以及蘋果酸的分泌120-126
• 5.4.4 WRKY46通過直接結(jié)合ALMT1的啟動(dòng)子調(diào)控其表達(dá)126-130
• 5.5 討論130-134
• 第6章 WRKY41調(diào)控?cái)M南芥的種子休眠134-180
• 6.1 前言134-136
• 6.2 問題的提出、擬解決的問題及技術(shù)路線136-138
• 6.2.1 問題的提出和擬解決的問題136-137
• 6.2.2 技術(shù)路線137-138
• 6.3 材料和方法138-144
• 6.3.1 實(shí)驗(yàn)材料138
• 6.3.2 植物培養(yǎng)條件(同3.3.2)138
• 6.3.3 載體構(gòu)建138-139
• 6.3.4 擬南芥轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)(同3.3.4)139
• 6.3.5 T-DNA插入突變體純合株系的PCR鑒定(同3.3.5)139
• 6.3.6 發(fā)芽與根伸長實(shí)驗(yàn)139
• 6.3.7 干旱處理和失水率測(cè)定139-140
• 6.3.8 種子ABA含量的測(cè)定140
• 6.3.9 GUS染色(同3.3.12)140
• 6.3.10 基因表達(dá)分析140
• 6.3.11 蛋白提取和Western blot測(cè)定140
• 6.3.12 煙草葉片瞬時(shí)表達(dá)實(shí)驗(yàn)140-141
• 6.3.13 重組蛋白的純化和凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)(EMSA)141
• 6.3.14 染色質(zhì)免疫共沉淀141-144
• 6.4 結(jié)果144-170
• 6.4.1 WRKY41的功能缺失導(dǎo)致種子的初生休眠降低144-147
• 6.4.2 WRKY41主要在種子中表達(dá)147
• 6.4.3 wrky41突變體的種子萌發(fā)和幼苗生長對(duì)ABA不敏感147-151
• 6.4.4 WRKY41正調(diào)控ABA信號(hào)途徑和種子成熟相關(guān)基因的表達(dá)151-153
• 6.4.5 WRKY41的功能缺失降低種子的熱抑制休眠153-155
• 6.4.6 WRKY41的功能缺失影響莢果中種子成熟相關(guān)基因的表達(dá)155
• 6.4.7 WRKY41在種子成熟及萌發(fā)階段調(diào)控ABI3的表達(dá)155-158
• 6.4.8 WRKY41不在ABA下游調(diào)控ABI3的表達(dá)158-162
• 6.4.9 WRKY41對(duì)ABI3的調(diào)控不依賴于ABA的合成代謝、ABA信號(hào)途徑以及其它調(diào)控ABI3轉(zhuǎn)錄表達(dá)的因子162-165
• 6.4.10 WRKY41體外結(jié)合ABI3啟動(dòng)子165
• 6.4.11 WRKY41在煙草葉片中轉(zhuǎn)錄激活A(yù)BI3啟動(dòng)子165-167
• 6.4.12 WRKY41與ABI3啟動(dòng)子體內(nèi)結(jié)合167-168
• 6.4.13 高濃度的ABA反饋調(diào)控WRKY41的表達(dá)168-170
• 6.5 討論170-180
• 6.5.1 WRKY41轉(zhuǎn)錄激活A(yù)BI3的表達(dá)并調(diào)控種子的休眠171-173
• 6.5.2 WRKY41與ABA信號(hào)途徑173-174
• 6.5.3 WRKY轉(zhuǎn)錄因子在種子發(fā)育和萌發(fā)過程中的作用174-180
• 第7章 全文總結(jié)180-183
• 7.1 主要研究結(jié)論180-181
• 7.2 創(chuàng)新點(diǎn)181
• 7.3 研究展望181-183
• 參考文獻(xiàn)183-220
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷220-221
• 博士期間發(fā)表的論文221

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前3條

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2 ;Aluminum-activated Oxalate Secretion does not Associate with Internal Content among Some Oxalate Accumulators[J];Journal of Integrative Plant Biology;2008年09期

3 楊建立,何云峰,鄭紹建;植物耐鋁機(jī)理研究進(jìn)展[J];植物營養(yǎng)與肥料學(xué)報(bào);2005年06期

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本文編號(hào)：888839