本文關(guān)鍵詞：胎牛皮脫細(xì)胞真皮基質(zhì)在組織工程中的應(yīng)用

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【摘要】：應(yīng)用組織工程技術(shù)構(gòu)建自體來源的新生組織或器官以修復(fù)損傷的組織器官一直是再生醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域的一個(gè)夢(mèng)想。將適宜的種子細(xì)胞在生物支架材料上培養(yǎng)和誘導(dǎo)，以構(gòu)建組織工程化的組織或器官（Tissue Engineered tissue or organ），修復(fù)組織損傷和器官缺損是再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究重點(diǎn)，而生物支架材料又是組織工程研究的三大要素之一。脫細(xì)胞真皮基質(zhì)是去除皮膚組織中抗原性很強(qiáng)的細(xì)胞成分包括表皮、皮膚的附屬器（毛囊、皮脂腺、汗腺）和真皮內(nèi)的血管內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等及皮下脂肪組織后，所剩余的免疫原性相對(duì)較弱的細(xì)胞外基質(zhì)及真皮層的膠原纖維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。人皮、豬皮脫細(xì)胞真皮基質(zhì)已廣泛用于醫(yī)學(xué)臨床的燒傷和創(chuàng)傷修復(fù)領(lǐng)域，產(chǎn)生了很好的治療效果，但受其來源、宗教、價(jià)格等方面的限制，使用有一定局限性。因生物制藥對(duì)胎牛血清的大量需求，導(dǎo)致了很多胎牛皮副產(chǎn)物被廢棄。胎牛皮真皮的組織結(jié)構(gòu)與人真皮相似，是天然的生物支架材料。由于胎牛處于生長(zhǎng)發(fā)育階段，胎牛皮（特別是3~5月齡的胎牛皮）的毛囊發(fā)育不完善，組成真皮的膠原纖維主要是膠原原纖維，與人皮或豬皮相比，其抗原性成分更易除去，其基質(zhì)成分更易被機(jī)體組織細(xì)胞作為營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收。因此，研究胎牛皮脫細(xì)胞真皮基質(zhì)（FBADM）的制備及其作為組織工程的生物支架和損傷修復(fù)的生物敷料，不僅可為胎牛皮的合理開發(fā)利用提供理論依據(jù)，而且可變廢為寶，，為組織工程和醫(yī)學(xué)臨床提供大量?jī)?yōu)質(zhì)的天然生物支架材料，對(duì)促進(jìn)胎牛皮的合理開發(fā)利用和我國(guó)再生醫(yī)學(xué)的發(fā)展具有重要的現(xiàn)實(shí)意義和實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。 本文以3~5月齡胎牛皮制備FBADM，在確定抗原成分被去除后，用FBADM作為三維生物支架，分別以非洲綠猴腎細(xì)胞、嬰兒皮膚細(xì)胞和人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BM-MSCs）為種子細(xì)胞，進(jìn)行體外復(fù)合培養(yǎng)，并進(jìn)一步對(duì)復(fù)合培養(yǎng)的BM-MSCs進(jìn)行軟骨、神經(jīng)分化誘導(dǎo)，研究FBADM的生物相容性和作為組織工程生物支架材料的可能性及其在干細(xì)胞培養(yǎng)、組織工程皮膚、軟骨和神經(jīng)構(gòu)建中的應(yīng)用前景。本論文試驗(yàn)研究分為五部分： 第一部分主要研究FBADM的表征與結(jié)構(gòu)。結(jié)果顯示：以3~5月齡胎牛皮制備的FBADM在水中呈乳白色，絲綢般柔軟、柔韌而富有彈性，具有生物力學(xué)性能，耐撕扯和適宜外科手術(shù)縫合。掃描電鏡顯示：FBADM厚度在60~200μm之間，由4~6層膠原纖維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)構(gòu)成。脫細(xì)胞處理可能會(huì)導(dǎo)致真皮乳頭層的表面基底膜發(fā)生損傷。在基底膜損傷處膠原纖維縱橫交錯(cuò)；在基底膜完整的部位，表面有3~10μm的孔狀結(jié)構(gòu)；真皮皮下組織面呈纖細(xì)的膠原纖維網(wǎng)狀。石蠟切片H.E染色顯示：FBADM主要由膠原纖維構(gòu)成，無(wú)細(xì)胞碎片和細(xì)胞核物質(zhì)殘留，DNA殘留檢測(cè)陰性，說明抗原性異物處理的干凈、徹底。 第二部分主要研究FBADM與異種動(dòng)物的體內(nèi)生物相容性。分別將1cm2大小的FBADM滅菌、復(fù)水后，埋植于威斯特大鼠和昆明小白鼠的背部皮下，飼養(yǎng)觀察，檢測(cè)FBADM對(duì)動(dòng)物的急性毒性和與異種動(dòng)物的生物相容性。結(jié)果：埋植后飼養(yǎng)觀察35d，兩種試驗(yàn)動(dòng)物生命體征和飲食正常，未發(fā)生急性毒性反應(yīng)。35d后，解剖部分大鼠和小鼠，制備石蠟切片，觀察顯示有大量成纖維細(xì)胞長(zhǎng)入FBADM中，局部有微血管形成，F(xiàn)BADM基質(zhì)周圍未見炎性細(xì)胞聚集。提示：在大鼠和小鼠體內(nèi)，F(xiàn)BADM具有良好的生物相容性，并可促進(jìn)毛細(xì)血管的生成，無(wú)免疫排斥反應(yīng)發(fā)生。 第三部分主要研究FBADM與異種動(dòng)物細(xì)胞的體外生物相容性和其作為細(xì)胞培養(yǎng)支架進(jìn)行三維立體培養(yǎng)的可能性。結(jié)果顯示：不論在FBADM周圍，還是在FBADM表面及其內(nèi)部網(wǎng)狀組織結(jié)構(gòu)中，非洲綠猴腎細(xì)胞（Vero細(xì)胞）均能良好生長(zhǎng)、增殖，細(xì)胞形態(tài)正常。經(jīng)3~4次胰蛋白酶消化處理后，Vero細(xì)胞仍能在FBADM上良好生長(zhǎng)。說明FBADM對(duì)異種動(dòng)物腎細(xì)胞細(xì)胞無(wú)毒性而有良好的生物相容性，對(duì)胰蛋白酶的消化具有一定的耐受性，可作為體外細(xì)胞三維培養(yǎng)的支架材料。 第四部分主要研究FBADM在皮膚組織工程領(lǐng)域的應(yīng)用。以FBADM為組織工程皮膚支架，并人為將基質(zhì)剪開、造成損傷后，將嬰兒皮膚細(xì)胞種植于FBADM上，進(jìn)行體外復(fù)合培養(yǎng)，觀察細(xì)胞生長(zhǎng)和損傷基質(zhì)的修復(fù)。結(jié)果：掃描電鏡和石蠟切片均顯示：皮膚細(xì)胞在FBADM表面和內(nèi)部網(wǎng)狀組織中均能良好生長(zhǎng)、增殖，并在10d內(nèi)有新生血管生成；人為剪開的基質(zhì)缺損，在體外復(fù)合培養(yǎng)35~56d后，完全長(zhǎng)到了一起。表明FBADM與嬰兒皮膚細(xì)胞不僅有良好的生物相容性，而且可誘導(dǎo)血管的形成，是構(gòu)建組織工程皮膚的良好支架材料，也可促進(jìn)組織損傷的修復(fù)。 第五部分主要研究FBADM作為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BM-MSCs）體外培養(yǎng)和分化誘導(dǎo)培養(yǎng)支架的可能性及BM-MSCs在FBADM上的軟骨和神經(jīng)分化。結(jié)果：倒置相差顯微鏡、掃描電鏡、石蠟切片、激光共聚焦顯微鏡和免疫熒光染色等技術(shù)監(jiān)測(cè)顯示：將BM-MSCs種植于FBADM上，用HyClone STEM Basal Media（BM）進(jìn)行三維復(fù)合培養(yǎng)，細(xì)胞能夠良好生長(zhǎng)和增殖，8~34d可自然形成血管和神經(jīng)樣分化結(jié)構(gòu)；45d后，細(xì)胞在FBADM上形成了復(fù)雜的多層結(jié)構(gòu)；而FBADM原有的相對(duì)較粗大、致密的膠原纖維束變得纖細(xì)而彎曲。提示在細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的過程中，基質(zhì)中的膠原纖維可被降解和吸收利用；經(jīng)軟骨分化培養(yǎng)基（CDM）誘導(dǎo)分化培養(yǎng)后，細(xì)胞能夠在FBADM上增殖，產(chǎn)生大量基質(zhì)纖維，經(jīng)軟骨基質(zhì)特異性甲苯胺藍(lán)染色，呈淡紅色異染的陽(yáng)性反應(yīng)；用神經(jīng)分化培養(yǎng)基(NDM)誘導(dǎo)分化培養(yǎng)后，形成了抗神經(jīng)元特異性抗體染色陽(yáng)性、具有典型的兩級(jí)和多極神經(jīng)元形態(tài)的細(xì)胞，復(fù)合培養(yǎng)物表面分化細(xì)胞形成了縱橫交錯(cuò)的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)和神經(jīng)信號(hào)回路。提示了BM-MSCs能夠在FBADM上增殖并可向軟骨細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞分化，F(xiàn)BADM可作為BM-MSCs培養(yǎng)和軟骨與神經(jīng)分化誘導(dǎo)培養(yǎng)的生物支架。 結(jié)論：胎牛皮脫細(xì)胞真皮基質(zhì)具有良好的生物相容性，可作為異種動(dòng)物細(xì)胞和干細(xì)胞培養(yǎng)的生物支架，培養(yǎng)嬰兒皮膚細(xì)胞和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，有利于細(xì)胞的增殖，并可促進(jìn)細(xì)胞向血管和神經(jīng)細(xì)胞分化，可作為組織工程皮膚、軟骨和神經(jīng)構(gòu)建的支架材料，在組織工程皮膚、軟骨與神經(jīng)構(gòu)建中具有廣闊的應(yīng)用前景。
【關(guān)鍵詞】：胎牛皮 脫細(xì)胞真皮基質(zhì) 組織修復(fù) 組織工程支架 皮膚細(xì)胞 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 軟骨分化 神經(jīng)分化
【學(xué)位授予單位】：甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R318.08
【目錄】：

• 摘要4-7
• Summary7-18
• 第一部分 文獻(xiàn)綜述18-32
• 一、組織工程概述18-21
• 二、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞21-23
• 三、生物支架材料23-24
• 四、脫細(xì)胞真皮基質(zhì)的優(yōu)勢(shì)24-25
• 五、組織工程的研究現(xiàn)狀25-30
• 1. 組織工程支架研究進(jìn)展25-27
• 2. 組織工程的種子細(xì)胞研究進(jìn)展27-28
• 3. 組織器官構(gòu)建的研究進(jìn)展28-30
• 4. 組織工程化組織與器官在臨床上的挑戰(zhàn)30
• 六、課題的提出30-32
• 第二部分 試驗(yàn)研究32-99
• 前言32-35
• 第一章 FBADM 的表面特征與結(jié)構(gòu)35-43
• 引言35
• 1. 材料與方法35-36
• 1.1 材料與設(shè)備35
• 1.2 試驗(yàn)方法35-36
• 1.2.1 外觀特征35
• 1.2.2 結(jié)構(gòu)測(cè)定35-36
• 1.2.2.1 石蠟切片制備與 H.E 染色35
• 1.2.2.2 掃描電鏡觀察35
• 1.2.2.3 透視電鏡觀察35
• 1.2.2.4 DNA 殘留提取35-36
• 1.2.3 保存與滅菌36
• 1.2.3.1 冷凍干燥保存36
• 1.2.3.2 Co~(60)輻照滅菌36
• 1.2.3.3 冷凍干燥及輻照滅菌后的復(fù)水效果36
• 2. 結(jié)果36-41
• 2.1 外觀特征觀察36-37
• 2.2 結(jié)構(gòu)檢測(cè)結(jié)果37-40
• 2.2.1 石蠟切片及 H.E 染色的結(jié)果37-38
• 2.2.2 掃描電鏡下的形態(tài)與結(jié)構(gòu)38-39
• 2.2.3 透視電鏡觀察39
• 2.2.4 DNA 殘留39-40
• 2.3 保存與滅菌40-41
• 2.3.1 冷凍干燥40
• 2.3.2 復(fù)水軟化40
• 2.3.3 Co~(60)輻照滅菌劑量確定40-41
• 3. 分析討論41-42
• 4. 結(jié)論42-43
• 第二章 FBADM 的生物相容性43-55
• 引言43
• 第一節(jié) 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)埋植試驗(yàn)43-46
• 1. 材料與方法43-44
• 1.1 試驗(yàn)材料43-44
• 1.1.1 埋植材料43-44
• 1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物44
• 1.1.3 其它44
• 1.2 試驗(yàn)方法44
• 1.2.1 材料的準(zhǔn)備44
• 1.2.2 皮下埋植44
• 1.2.3 觀測(cè)44
• 2. 試驗(yàn)結(jié)果44-45
• 2.1 活體觀察44
• 2.2 石蠟切片觀察44-45
• 3. 分析討論45-46
• 4. 結(jié)論46
• 第二節(jié) FBADM 的體外細(xì)胞相容性46-55
• 1. 材料與方法46-48
• 1.1 材料46-47
• 1.1.1 試驗(yàn)材料46-47
• 1.1.2 試驗(yàn)設(shè)備47
• 1.2 試驗(yàn)方法47-48
• 1.2.1 試驗(yàn)用 FBADM 的準(zhǔn)備47
• 1.2.2 準(zhǔn)備細(xì)胞懸液47
• 1.2.3 細(xì)胞接種與培養(yǎng)47
• 1.2.4 細(xì)胞生長(zhǎng)監(jiān)測(cè)47-48
• 1.2.4.1 細(xì)胞生長(zhǎng)曲線和細(xì)胞活力測(cè)定47-48
• 1.2.4.2 細(xì)胞形態(tài)觀察48
• 2. 結(jié)果48-52
• 2.1 細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖48-49
• 2.2 細(xì)胞的活力檢測(cè)49-50
• 2.3 細(xì)胞形態(tài)觀察50-52
• 3. 分析討論52-54
• 4. 結(jié)論54-55
• 第三章 FBADM 作為皮膚組織工程支架的研究55-63
• 引言55-57
• 1. 材料與方法57-58
• 1.1 材料與設(shè)備57
• 1.1.1 試驗(yàn)材料57
• 1.1.2 試驗(yàn)儀器和設(shè)備57
• 1.2 試驗(yàn)方法57-58
• 1.2.1 FBADM 的準(zhǔn)備57
• 1.2.2 制備細(xì)胞懸液57
• 1.2.3 接種細(xì)胞57
• 1.2.4 觀察與檢測(cè)57-58
• 2. 結(jié)果58-61
• 2.1 FBADM 對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響58-59
• 2.2 FBADM 與損傷愈合59
• 2.3 FBADM 與血管形成59-61
• 3. 分析討論61-62
• 4. 結(jié)論62-63
• 第四章 FBADM 作為干細(xì)胞培養(yǎng)支架的研究63-73
• 引言63-64
• 1. 材料與方法64-66
• 1.1 材料與設(shè)備64-65
• 1.1.1 試驗(yàn)材料64-65
• 1.1.2 試驗(yàn)設(shè)備65
• 1.2 試驗(yàn)方法65-66
• 1.2.1 hBM-MSCs 細(xì)胞的復(fù)蘇65
• 1.2.2 hBM-MSCs 細(xì)胞的分化特性鑒定65-66
• 1.2.3 hBM-MSCs 在 FBADM 上的增殖培養(yǎng)66
• 1.2.3.1 FBADM 的準(zhǔn)備66
• 1.2.3.2 細(xì)胞接種66
• 1.2.3.3 細(xì)胞生長(zhǎng)監(jiān)測(cè)66
• 2. 結(jié)果66-70
• 2.1 復(fù)蘇后 hBM-MSCs 的分化特性66-68
• 2.2 hBM-MSCs 在 FBADM 上的增殖與分化68-70
• 3. 分析討論70-72
• 4. 結(jié)論72-73
• 第五章 hBM-MSCs 在 FBADM 上軟骨分化誘導(dǎo)73-84
• 引言73-75
• 1. 材料與方法75-77
• 1.1 材料與設(shè)備75
• 1.1.1 試驗(yàn)材料75
• 1.1.2 試驗(yàn)設(shè)備75
• 1.2 試驗(yàn)方法75-77
• 1.2.1 24 孔板培養(yǎng)法76
• 1.2.1.1 細(xì)胞懸液制備76
• 1.2.1.2 FBADM 準(zhǔn)備76
• 1.2.1.3 細(xì)胞接種與分化誘導(dǎo)76
• 1.2.2 離心管深層培養(yǎng)法76
• 1.2.2.1 離心管準(zhǔn)備76
• 1.2.2.2 細(xì)胞的準(zhǔn)備76
• 1.2.2.3 細(xì)胞的接種與分化誘導(dǎo)76
• 1.2.4 細(xì)胞生長(zhǎng)檢測(cè)76-77
• 2. 結(jié)果77-81
• 2.1 平板培養(yǎng)法77-80
• 2.2 離心管深層培養(yǎng)法80-81
• 3. 分析討論81-83
• 4. 結(jié)論83-84
• 第六章 BM-MSCs 在 FBADM 上神經(jīng)分化誘導(dǎo)84-99
• 引言84-86
• 1. 材料與方法86-88
• 1.1 材料與設(shè)備86
• 1.1.1 試驗(yàn)材料86
• 1.1.2 試驗(yàn)設(shè)備86
• 1.2 方法86-88
• 1.2.1 BM-MSCs 的復(fù)蘇與分化特性86
• 1.2.2 FBADM 的準(zhǔn)備86-87
• 1.2.3 細(xì)胞接種與增殖培養(yǎng)87
• 1.2.4 神經(jīng)分化誘導(dǎo)培養(yǎng)與控制87
• 1.2.5 免疫熒光染色87
• 1.2.6 掃描電子顯微鏡樣品準(zhǔn)備87-88
• 1.2.7 石臘切片88
• 1.2.8 SPSS 統(tǒng)計(jì)軟件88
• 2. 結(jié)果88-96
• 2.1 倒置相差顯微鏡的觀察結(jié)果88-90
• 2.2 免疫熒光染色90-91
• 2.3 SEM 觀察結(jié)果91-93
• 2.4 石蠟切片93-94
• 2.5 SPSS 分析結(jié)果94-96
• 3. 分析討論96-97
• 4. 結(jié)論97-99
• 全文主要結(jié)論99-100
• 參考文獻(xiàn)100-116
• 作者簡(jiǎn)介116
• 在讀期間發(fā)表論文和研究成果116-117
• 導(dǎo)師簡(jiǎn)介117-118
• 致謝118

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：560710