本文關(guān)鍵詞：生物激發(fā)子與氧化還原相關(guān)信號對植物生長和抗病性的調(diào)控作用

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【摘要】： 隨著人們對農(nóng)作物上使用農(nóng)藥的關(guān)心，尋找一種安的保護農(nóng)作物的方法是全世界努力的方向。生防細菌和其他一些天然來源的材料在病害防治和提高產(chǎn)量上有著巨大的應(yīng)用潛力。Pseudomonas和Bacillus species是一類非常重要的生防細菌，以多種機理保護植物，也能促進種子發(fā)芽和植物生長。Harpin是多種植物病原細菌產(chǎn)生的Ⅲ型效應(yīng)因子的蛋白質(zhì)，在病原菌侵染的時候泌出激發(fā)植物的多種反應(yīng)，外源施用到植物上能引起多種有利效應(yīng)。HpaG_(xoo)，Xanthomonas oryzae pv．oryzae產(chǎn)生的一種harpin蛋白質(zhì)，能激發(fā)植物對病原菌和昆蟲的防衛(wèi)反應(yīng)，促進植物生長，hpaG_(xoo)的轉(zhuǎn)基因煙草系統(tǒng)獲得抗性(systemic acquired resistance，SAR)受到誘導(dǎo)。生防細菌在根部的定殖能誘導(dǎo)植物的ISR(induced systemic resistance，誘導(dǎo)系統(tǒng)抗性)，ISR與SAR拮抗，賦予植物截然不同的抗病機理。因此，Ⅲ型效應(yīng)因子和生防細菌一起使用很可能比其中一個單獨使用對植物具有更好的誘導(dǎo)作用。本研究的目的是探清生防細菌和Ⅲ型效應(yīng)因子是如何互作的，如何影響植物的生長和抗病性。P．cepacia P6854和B．subtilisB-916對水稻紋枯病有比較好的防效，我們產(chǎn)生了hpaG_(xoo)的轉(zhuǎn)基因水稻(品種R109)的一些株系，研究發(fā)現(xiàn)HpaG_(xoo)-expressing rice line 1 (HER1)生長較快，對鹽脅迫和病原菌的防衛(wèi)反應(yīng)較強。 Elicitin是疫霉菌產(chǎn)生的一類寄主特異性蛋白質(zhì)激發(fā)子，能誘導(dǎo)多種煙屬植物、蘿卜和蕓苔產(chǎn)生過敏反應(yīng)(hypersensitive response，HR)，但對番茄、馬鈴薯等茄科植物，多數(shù)十字花科植物等無效。Elicitin不僅能誘導(dǎo)植物的過敏反應(yīng)，也能誘導(dǎo)多種植物的多種防衛(wèi)反應(yīng)，例如：可以誘導(dǎo)煙草抗黑脛病(P．parasitica)和由Xanthomonascampestris pv armoraciae引起的病害，也能使煙草抗TMV的侵染。Harpins和elicitins這兩類重要的激發(fā)子，誘導(dǎo)植物抗病、抗逆的機理既有相似之處，又有不同，二者共同作用于植物時，是否能協(xié)同作用，需要進一步研究。在本研究中構(gòu)建了能同時表達兩種激發(fā)子的工程菌，研究了該雙元激發(fā)子的工程菌的蛋白粗提液與單元激發(fā)子蛋白粗提液引起煙草的微敏反應(yīng)和系統(tǒng)抗病性的差異。 核黃素(VB_2)在細菌和高等生物內(nèi)是核黃素結(jié)合輔酶FMN和FAD的重要成分，F(xiàn)MN和FAD是主要的酶促反應(yīng)如氫化物、氧和電子傳遞反應(yīng)的酶的輔酶因子，是一種多功能性的維生素，對動植物、微生物的生長、抗病都有很重要的作用。核黃素在植物和微生物中都能自我合成，合成途徑的倒數(shù)第二步是由2，4-二氫喋啶合酶(lumazine synthase，LS)催化的，倒數(shù)第一步是由核黃素合酶(riboflavin synthase，RS)催化的。動物和人類都缺少這兩種酶，，但是很多細菌和酵母卻依賴這兩種酶形成內(nèi)源核黃素，很久以來LS和RS蛋白質(zhì)高級結(jié)構(gòu)得到很好的研究，用來設(shè)計疫苗，治療人類和動物的疾病，很多細菌和酵母編碼LS和RS蛋白質(zhì)的基因已經(jīng)得到克隆。在擬南芥中發(fā)現(xiàn)LS與茉莉酸途徑相交叉，與根對茉莉酸的敏感性、植物的抗病性密切相關(guān)。由此可推斷水稻上的OsLS和OsRS很可能存在著目前不為所知的功能，在植物上編碼這兩個酶的基因的報道不多，尤其是水稻的這兩個基因根本還沒得到克隆。 硫氧還蛋白(thioredoxin，TRX)是一種小分子量蛋白質(zhì)，催化巰基-二硫鍵的交換反應(yīng)，參與細胞還原環(huán)境的調(diào)節(jié)，在不同的組織和器官內(nèi)有不同的構(gòu)象，具有多功能性。目前已經(jīng)在多種微生物、植物和動物內(nèi)克隆到該基因，細胞質(zhì)、葉綠體和線粒體內(nèi)都有多種構(gòu)象的硫氧還蛋白，除了能消除氧脅迫，這種蛋白質(zhì)越來越多的功能被發(fā)現(xiàn)。煙草上該基因(NtTRX)的功能研究甚少，在生長和抗病性上的功能尚未見報道。 本博士論文的研究目的就是初步研究清楚激發(fā)子HpaG_(xoo)與生防細菌P．cepacia和B．subtilis或者激發(fā)子ParAl一起使用時對植物的生長、抗病性和過敏反應(yīng)的影響是否存在互作；水稻的核黃素合成過程的酶促步驟的OsLS和OsRS基因和煙草的其中一個氧化還原作用的NtTRX基因(NtTRXh)在植物的生長、抗病性、細胞死亡和活性氧脅迫上的作用。研究結(jié)果如下： 1生物激發(fā)子與生防細菌協(xié)同作用影響檀物的生長、抗病和過敏反應(yīng) 為了搞清生防細菌和HpaG_(Xoo)在作物上一起存在時是否能夠?qū)χ参锏纳L和抗病有更好的作用，研究了P．cepacia和B．subtilis在野生型水稻R109和表達hpaG_(xoo)的水稻株系HER1上的作用。與野生型R109相比，HER1的長勢較好、產(chǎn)量高、對病害和鹽脅迫的抗性強。與水處理的對照相比，P．cepacia和B．subtilis的定殖促進R109和HER1根的生長，也能促進R109莖葉的生長，但是HER1莖葉的生長受到抑制。接種紋枯病菌(Rhizoctonia solani)后用P．cepacia和B．subtilis處理，R109和HER1的發(fā)病程度都比對照輕，而且HER1有更好的抗性，這說明P．cepacia、B．subtilis和HpaG_(xoo)在誘導(dǎo)植物的抗病性上相互協(xié)作。P．cepacia和B．subtilis在根部定殖后，HER1和R109上一些與生長和防衛(wèi)密切相關(guān)的基因具有不同的表達譜。在R109的根內(nèi)，調(diào)控植物生長的OsARF1表達量與P．cepacia和B．subtilis對生長的促進作用是一致的，相反在HER1的莖葉內(nèi)，OsARF1表達量與P．cepacia和B．subtilis對水稻的抑制作用相一致。在R109和HER1內(nèi)參與植物生長的編碼延展蛋白的OsEXP1對P．cepacia的反應(yīng)在莖葉內(nèi)與生長一致，但是在根內(nèi)卻不一致。OsMAPK編碼細胞分裂素激活的蛋白質(zhì)激酶，調(diào)控水稻內(nèi)對鹽和病菌侵染的防衛(wèi)反應(yīng)，P．cepacia和B．subtilis處理后，R109內(nèi)OsMAPK的早期表達與抗病性是一致的，但是HER1受P．cepacia處理還是不處理，OsMAPK的表達量都是相似的。顯然P．cepacia、B．subtilis和HpaG_(xoo)在水稻的生長和抗病性上的互作是不同的，然而P．cepacia、B．subtilis和HpaG_(xoo)在抗病性方面的協(xié)作在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上具有巨大的應(yīng)用潛力，生防細菌、Ⅲ型效應(yīng)因子和病原菌的互作原理值得深入研究。 ParAl和hpaG_(xoo)基因同時連接到表達載體pET30a(+)上，構(gòu)建二元重組質(zhì)粒pET30a(+)：：parAl：：hpaG_(xoo)，轉(zhuǎn)化BL21(DE3)，生成工程菌株BL21：：parAl：：ApaG_(xoo)。Tris-Tricine緩l栂低車?yán)i痙⑾鄭辛教

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