本文關(guān)鍵詞：鹽膚木對(duì)角倍蚜刺激的生理及分子應(yīng)答研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：角倍由于其中單寧含量豐富而被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、化工等各個(gè)行業(yè)。角倍是蚜蟲(chóng)與植物相互作用形成的蟲(chóng)癭，了解蚜蟲(chóng)刺激植物后，植物對(duì)蚜蟲(chóng)的生理及分子應(yīng)答具有重要的科學(xué)意義。 本研究通過(guò)對(duì)保護(hù)酶及膜損傷相關(guān)化學(xué)成分的檢測(cè)，判斷角倍蚜對(duì)鹽膚木造成氧化性損傷及細(xì)胞膜傷害的可能性，從側(cè)面反映二者之間可能存在的生態(tài)關(guān)系。轉(zhuǎn)化酶活性測(cè)定與轉(zhuǎn)化酶基因的表達(dá)分析分別從蛋白與核酸水平討論鹽膚木葉片與倍子之間的營(yíng)養(yǎng)分配情況以及轉(zhuǎn)化酶在角倍形成中發(fā)揮的作用。通過(guò)cDNA-AFLP方法在轉(zhuǎn)錄組水平上篩選出參與應(yīng)答反應(yīng)的基因，用于對(duì)角倍形成相關(guān)基因的研究。以上三方面鹽膚木生理及分子應(yīng)答反應(yīng)研究工作獲得的主要結(jié)果如下： 1.蟲(chóng)癭形成過(guò)程中寄主植物保護(hù)酶等生理指標(biāo)的反應(yīng)：保護(hù)酶是植物遭受氧化性損傷時(shí)的防御性蛋白。對(duì)各時(shí)期蟲(chóng)癭組與無(wú)蟲(chóng)癭組之間超氧化物歧化酶（SOD）、過(guò)氧化氫酶（CAT）、過(guò)氧化物酶（POD）等保護(hù)酶活性的比較結(jié)果顯示各指標(biāo)在兩組之間均無(wú)顯著差別（P＜0.05）�？扇苄钥偟鞍缀透彼嵩谥|(zhì)膜遭到損壞時(shí)具有調(diào)節(jié)作用，而丙二醛反映出膜的氧化程度，三種活性物質(zhì)比較分析結(jié)果顯示兩組葉片之間無(wú)顯著差別（P＜0.05）。以上結(jié)果說(shuō)明蚜蟲(chóng)取食以及數(shù)量的增加可能并為造成寄主植物嚴(yán)重的氧化性損傷或者對(duì)植物細(xì)胞膜的傷害，所以未能產(chǎn)生常見(jiàn)的防御性反應(yīng)，角倍蚜與鹽膚木之間的關(guān)系區(qū)別于其它寄主植物上的蟲(chóng)害關(guān)系，二者或許以“共生”方式存在。各生理指標(biāo)在兩組葉片中變化趨勢(shì)的比較中發(fā)現(xiàn)，可溶性總蛋白含量在后期變化趨勢(shì)上存在顯著差異（P＜0.05），這說(shuō)明角倍蚜取食造成了寄主植物生理代謝的改變，，這一方面可能反映出葉片與角倍之間蛋白分配的改變，另一方面說(shuō)明了它對(duì)葉片生長(zhǎng)發(fā)育進(jìn)程的影響。 2.蟲(chóng)癭形成過(guò)程中轉(zhuǎn)化酶活性反應(yīng)：轉(zhuǎn)化酶是植物糖代謝過(guò)程中的關(guān)鍵酶，在植物生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)節(jié)中具有重要作用。對(duì)有倍葉、無(wú)倍葉以及倍子中液泡型酸性轉(zhuǎn)化酶、細(xì)胞質(zhì)型中性轉(zhuǎn)化酶、細(xì)胞壁型酸性轉(zhuǎn)化酶與細(xì)胞壁型中性轉(zhuǎn)化酶四種類(lèi)型轉(zhuǎn)化酶活性進(jìn)行比較，其中液泡型轉(zhuǎn)化酶與細(xì)胞壁型轉(zhuǎn)化酶活性在葉片整個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中迅速降低（P＜0.05），說(shuō)明葉片的生長(zhǎng)發(fā)育與三種轉(zhuǎn)化酶活性呈負(fù)相關(guān)；細(xì)胞壁型轉(zhuǎn)化酶活性在角倍形成初期未能檢測(cè)到，液泡型轉(zhuǎn)化酶則隨角倍生長(zhǎng)顯著下降，反映出角倍生長(zhǎng)發(fā)育與液泡型轉(zhuǎn)化酶之間的負(fù)相關(guān)關(guān)系。角倍細(xì)胞質(zhì)型中性轉(zhuǎn)化酶活性顯著升高（P＜0.05），與其胞內(nèi)酸性酶活性持續(xù)降低相對(duì)應(yīng)，胞質(zhì)中性轉(zhuǎn)化酶或許作為維持酶存在。倍子中酸性轉(zhuǎn)化酶活性始終高于葉片，且有倍葉中活性高于無(wú)倍葉，無(wú)倍葉可能以源葉形式存在，倍子從中獲取營(yíng)養(yǎng)增加庫(kù)強(qiáng)。植物通過(guò)對(duì)四種轉(zhuǎn)化酶活性的調(diào)節(jié)實(shí)現(xiàn)對(duì)角倍生長(zhǎng)發(fā)育的調(diào)節(jié)，而酸性轉(zhuǎn)化酶則在葉片與倍子的營(yíng)養(yǎng)分配中發(fā)揮重要作用。 3.鹽膚木轉(zhuǎn)化酶基因克隆及角倍形成過(guò)程中基因表達(dá)分析：轉(zhuǎn)化酶基因的克隆與表達(dá)分析是實(shí)現(xiàn)角倍生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控的基礎(chǔ)。本研究克隆獲得細(xì)胞質(zhì)型轉(zhuǎn)化酶基因INV1、細(xì)胞壁型轉(zhuǎn)化酶基因INV2與液泡型轉(zhuǎn)化酶基因INV3，三種轉(zhuǎn)化酶基因在不同組織中的熒光定量結(jié)果顯示INV2的表達(dá)具有組織與發(fā)育特異性，而且其表達(dá)可能對(duì)倍子形成以及快速生長(zhǎng)發(fā)揮正調(diào)控作用。液泡型轉(zhuǎn)化酶基因INV3的表達(dá)在有倍葉與倍子中呈現(xiàn)出相同的下降趨勢(shì)，而無(wú)倍葉僅在倍子快速生長(zhǎng)時(shí)顯著下降，該基因可能對(duì)角倍形成的早期調(diào)控具有更為重要的意義。細(xì)胞質(zhì)型轉(zhuǎn)化酶基因INV1的表達(dá)在角倍形成晚期倍子中表達(dá)量才顯著高于無(wú)倍葉，說(shuō)明該基因可能也與角倍快速生長(zhǎng)有關(guān)。由以上結(jié)果推測(cè)，INV1基因的表達(dá)可能促進(jìn)角倍的快速生長(zhǎng)，INV2基因的增量表達(dá)可能利于角倍的形成以及快速生長(zhǎng)，而INV3基因可能參與角倍生長(zhǎng)的早期調(diào)控。 4.鹽膚木分子應(yīng)答相關(guān)基因篩選及功能分析：角倍蚜取食造成植物不同組織差異表達(dá)基因的篩選是對(duì)角倍形成相關(guān)基因的初步判斷，對(duì)其功能的分析是蟲(chóng)癭形成分子機(jī)制的基礎(chǔ)。通過(guò)cDNA-AFLP方法在早期與角倍形成過(guò)程中分別篩選出64和71個(gè)參與應(yīng)答的基因，涉及光合作用、氧化還原反應(yīng)、基因表達(dá)調(diào)控、次生代謝、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)、應(yīng)激反應(yīng)、細(xì)胞命運(yùn)、細(xì)胞組分等多個(gè)方面，角倍蚜通過(guò)對(duì)植物代謝過(guò)程和細(xì)胞過(guò)程等的改變導(dǎo)致蟲(chóng)癭組織的形成。各候選基因參與的生物調(diào)節(jié)、細(xì)胞組分生物形成、細(xì)胞組分的組織、細(xì)胞過(guò)程、發(fā)育過(guò)程、定位的建立、定位、代謝過(guò)程、多細(xì)胞有機(jī)體過(guò)程、色素沉著、復(fù)制和應(yīng)激反應(yīng)等生物過(guò)程反映出植物分子應(yīng)答網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)的框架。
【關(guān)鍵詞】：角倍蚜 鹽膚木 生理應(yīng)答 分子應(yīng)答 cDNA-AFLP
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類(lèi)號(hào)】：S763.7
【目錄】：

• 摘要5-7
• Abstract7-14
• 表目錄14-15
• 圖目錄15-17
• 第一章 緒論17-37
• 1.1 引言17-34
• 1.1.1 研究背景17
• 1.1.2 五倍子研究現(xiàn)狀17-20
• 1.1.3 蟲(chóng)癭研究現(xiàn)狀及趨勢(shì)20-27
• 1.1.4 植物應(yīng)答反應(yīng)研究現(xiàn)狀及發(fā)展趨勢(shì)27-34
• 1.2 研究的目的和意義34-35
• 1.3 主要研究?jī)?nèi)容和技術(shù)路線35-37
• 第二章 角倍形成對(duì)鹽膚木保護(hù)酶及脂質(zhì)膜的影響37-48
• 2.1 材料和方法37-41
• 2.1.1 試驗(yàn)材料37-38
• 2.1.2 試驗(yàn)方法38-41
• 2.1.3 數(shù)據(jù)分析41
• 2.2 試驗(yàn)結(jié)果41-45
• 2.2.1 可溶性蛋白含量41-42
• 2.2.2 保護(hù)酶活性42-44
• 2.2.3 丙二醛含量44
• 2.2.4 脯氨酸含量44-45
• 2.3 小結(jié)與討論45-48
• 第三章 角倍形成過(guò)程中鹽膚木轉(zhuǎn)化酶活性變化48-57
• 3.1 材料和方法48-51
• 3.1.1 試驗(yàn)材料48-49
• 3.1.2 試驗(yàn)方法49-51
• 3.2 試驗(yàn)結(jié)果51-53
• 3.2.1 液泡型酸性轉(zhuǎn)化酶51
• 3.2.2 細(xì)胞質(zhì)中性轉(zhuǎn)化酶51-52
• 3.2.3 細(xì)胞壁酸性轉(zhuǎn)化酶52-53
• 3.2.4 細(xì)胞壁中性轉(zhuǎn)化酶53
• 3.3 小結(jié)與討論53-57
• 第四章 鹽膚木轉(zhuǎn)化酶基因的克隆與表達(dá)分析57-86
• 4.1 試驗(yàn)材料與方法58-67
• 4.1.1 試驗(yàn)材料58-59
• 4.1.2 試驗(yàn)方法59-67
• 4.2 結(jié)果與分析67-83
• 4.2.1 總 RNA 提取質(zhì)量及產(chǎn)量檢測(cè)67-68
• 4.2.2 三種轉(zhuǎn)化酶基因 EST 序列測(cè)序結(jié)果68
• 4.2.3 細(xì)胞壁酸性轉(zhuǎn)化酶基因與液泡酸性轉(zhuǎn)化酶基因 RACE 擴(kuò)增結(jié)果68-70
• 4.2.4 細(xì)胞壁型轉(zhuǎn)化酶基因與液泡型轉(zhuǎn)化酶基因序列拼接結(jié)果70
• 4.2.5 三個(gè)轉(zhuǎn)化酶基因的生物信息學(xué)分析70-81
• 4.2.6 三個(gè)轉(zhuǎn)化酶基因的熒光定量分析81-83
• 4.3 小結(jié)與討論83-86
• 第五章 鹽膚木對(duì)蟲(chóng)癭刺激早期應(yīng)答的 CDNA-AFLP 分析86-110
• 5.1 材料與方法86-92
• 5.1.1 試驗(yàn)材料86-87
• 5.1.2 試驗(yàn)方法87-92
• 5.2 結(jié)果與分析92-103
• 5.2.1 cDNA 雙鏈合成結(jié)果92-94
• 5.2.2 預(yù)擴(kuò)增結(jié)果94-95
• 5.2.3 選擇性擴(kuò)增結(jié)果95-96
• 5.2.4 差異片段再擴(kuò)增、回收與克隆96
• 5.2.5 差異表達(dá)序列分析96-102
• 5.2.6 差異片段 RT-PCR 驗(yàn)證102-103
• 5.3 討論與小結(jié)103-110
• 5.3.1 光合作用與鹽膚木早期應(yīng)答103-104
• 5.3.2 氧化還原與鹽膚木早期應(yīng)答104
• 5.3.3 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與鹽膚木早期應(yīng)答104-105
• 5.3.4 細(xì)胞命運(yùn)與鹽膚木早期應(yīng)答105-106
• 5.3.5 應(yīng)激反應(yīng)與鹽膚木早期應(yīng)答106-107
• 5.3.6 細(xì)胞組分與鹽膚木早期應(yīng)答107
• 5.3.7 跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)與鹽膚木早期應(yīng)答107-108
• 5.3.8 轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)與鹽膚木早期應(yīng)答108
• 5.3.9 小結(jié)108-110
• 第六章 角倍形成過(guò)程中鹽膚木應(yīng)答的 CDNA-AFLP 分析110-126
• 6.1 材料與方法111
• 6.1.1 試驗(yàn)材料111
• 6.1.2 試驗(yàn)方法111
• 6.2 結(jié)果與分析111-120
• 6.2.1 選擇性擴(kuò)增結(jié)果111
• 6.2.2 差異片段再擴(kuò)增、回收與克隆111-114
• 6.2.3 差異表達(dá)序列分析114-119
• 6.2.4 差異片段 RT-PCR 驗(yàn)證119-120
• 6.3 討論與小結(jié)120-126
• 6.3.1 應(yīng)激反應(yīng)與角倍形成中鹽膚木應(yīng)答反應(yīng)120-121
• 6.3.2 氧化還原反應(yīng)與角倍形成中鹽膚木應(yīng)答反應(yīng)121
• 6.3.3 次級(jí)代謝與角倍形成中鹽膚木應(yīng)答反應(yīng)121-122
• 6.3.4 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與角倍形成中鹽膚木應(yīng)答反應(yīng)122-123
• 6.3.5 轉(zhuǎn)錄、翻譯與角倍形成中鹽膚木應(yīng)答反應(yīng)123-124
• 6.3.6 細(xì)胞命運(yùn)與角倍形成中鹽膚木應(yīng)答反應(yīng)124
• 6.3.7 小結(jié)124-126
• 第七章 結(jié)論126-130
• 7.1 主要結(jié)論126-128
• 7.2 有待解決的問(wèn)題及研究方向128
• 7.3 本研究的創(chuàng)新點(diǎn)128-130
• 參考文獻(xiàn)130-159
• 附錄159-166
• 在讀期間的學(xué)術(shù)研究166-167
• 致謝167

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