本文關(guān)鍵詞：鹿茸發(fā)育相關(guān)基因篩選和生物信息學(xué)分析，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】： 鹿茸是一種骨質(zhì)性器官,每年都能脫落后再生,是哺乳動(dòng)物中唯一能完全再生的器官,其他的哺乳動(dòng)物無法再生出失去的器官。因此,鹿茸就提供了一個(gè)絕無僅有的模型來研究哺乳動(dòng)物內(nèi)在的再生機(jī)制。然而,鹿茸再生的分子機(jī)制至今沒有弄清楚。鹿茸發(fā)育是一個(gè)非常獨(dú)特的復(fù)雜的過程,涉及到軟骨內(nèi)成骨和膜內(nèi)成骨等骨生長方式。許多研究表明鹿茸再生是基于干細(xì)胞(骨膜細(xì)胞),不涉及到細(xì)胞的去分化,不同于蠑螈肢體再生過程。鹿茸再生首先形成胚芽或茸芽狀的復(fù)雜結(jié)構(gòu),在這個(gè)微環(huán)境中,存在細(xì)胞分裂、分化,鹿茸發(fā)育的干細(xì)胞,多能祖細(xì)胞受到復(fù)雜的信號(hào)調(diào)控。在梅花鹿的鹿茸發(fā)育中,細(xì)胞分化、增殖和凋亡都是受特定基因表達(dá)調(diào)控。鹿茸頂端的間充質(zhì)組織在鹿茸頂端的形態(tài)發(fā)生,乃至整個(gè)鹿茸的發(fā)育過程中起著重要的作用。 本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用cDNA-AFLP技術(shù)篩選梅花鹿鹿茸發(fā)育過程中兩個(gè)重要時(shí)期的間充質(zhì)組織的差異表達(dá)基因片段,獲得鹿茸發(fā)育相關(guān)的基因。這種技術(shù)是用兩種限制性內(nèi)切酶酶切,在嚴(yán)格的條件下,64對(duì)引物組合進(jìn)行擴(kuò)增,擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳,再進(jìn)行銀染,篩選出鹿茸發(fā)育過程中差異表達(dá)的轉(zhuǎn)錄本,然后用RT-PCR進(jìn)行鑒定,該實(shí)驗(yàn)可重復(fù)性強(qiáng)。得到許多兩個(gè)發(fā)育時(shí)期的鹿茸差異表達(dá)基因,選取9個(gè)差異表達(dá)基因進(jìn)行克隆測(cè)序,然后進(jìn)行EST生物信息學(xué)分析。首先對(duì)EST序列進(jìn)行預(yù)處理、聚類和拼接,把來源于同源于同一基因EST拼接成contig,其次利用nr數(shù)據(jù)庫,EST數(shù)據(jù)庫和GO數(shù)據(jù)庫,獲得更多的信息,并對(duì)EST進(jìn)行功能注釋。 結(jié)果表明有兩個(gè)片段來源于同一個(gè)基因,利用生物軟件拼接成contig ,即AF78,把未能拼接ESTs和此contig(AF78)進(jìn)行比對(duì)分析和功能注釋,獲得相關(guān)基因信息。上調(diào)基因有2個(gè),即AF1和AF2。AF1功能未知,AF2的同源序列是人的TRPV4,TRPV4通道是瞬時(shí)感受器電位離子通道家族香草素受體亞家族成員,屬非選擇性陽離子通道,對(duì)鈣離子具有適中通透性,在軟骨的形成中起著重要的作用。下調(diào)基因有6個(gè),即AF3-AF6,AF78 (contig)和AF9。其中AF6基因功能未知,AF3的同源序列是人的FAS,該基因是促凋亡基因,屬于腫瘤壞死因子受體家族成員之一,與哺乳類動(dòng)物細(xì)胞凋亡密切相關(guān);AF4的同源序列是人的WNT3,是Wnt基因家族成員,在細(xì)胞增殖、分化過程中起著重要的作用, Wnt信號(hào)通路在發(fā)育過程中具有重要的作用;AF5的同源序列是人的TGFβ1,是轉(zhuǎn)化生長因子β超家族的成員,該基因編碼的是一種分泌性蛋白,扮演著許多細(xì)胞功能,如對(duì)細(xì)胞生長,細(xì)胞增殖和分化,還有凋亡的調(diào)控;AF78的同源序列是獼猴的CDK2,周期依賴性激酶2,該基因編碼的是蛋白激酶家族的一員,啟動(dòng)真核細(xì)胞周期的關(guān)鍵時(shí)期; AF9的同源序列是人的APAF1,該基因稱為凋亡酶激活因子-1,在凋亡途徑中具有重要作用。這些功能已知的基因都與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),如Wnt/β-action , TGF/TGFR等信號(hào)通路;細(xì)胞分裂、增殖、分化和凋亡有關(guān),在鹿茸的發(fā)育過程中起著重要的作用,有些基因是鹿茸研究中首次提到的,有些是新基因,都通過RT-PCR進(jìn)行了驗(yàn)證。本實(shí)驗(yàn)為鹿茸再生和器官再生的進(jìn)一步研究奠定了基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：cDNA-AFLP 差異基因表達(dá) 鹿茸發(fā)育 鹿茸再生 間充質(zhì)組織 表達(dá)序列標(biāo)簽 生物信息學(xué)分析
【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號(hào)】：S865.42
【目錄】：

• 摘要6-7
• Abstract7-12
• 第一章 緒論12-29
• 1.1 鹿茸發(fā)育與再生機(jī)理的研究進(jìn)展12-17
• 1.1.1 鹿茸發(fā)育概述12-15
• 1.1.2 鹿茸再生及創(chuàng)傷修復(fù)15
• 1.1.3 鹿茸生長過程中的組織學(xué)15
• 1.1.4 鹿茸發(fā)育再生調(diào)控15-17
• 1.2 差異表達(dá)基因的篩選方法17-24
• 1.2.1 cDNA-RAPD 分析法17
• 1.2.2 m RNA 差異顯示17-18
• 1.2.3 代表性差別分析18-19
• 1.2.4 cDNA-AFLP19-21
• 1.2.5 抑制消減雜交法21
• 1.2.6 基因表達(dá)系列分析21-23
• 1.2.7 cDNA 微陣列23-24
• 1.3 生物信息學(xué)分析核酸概述24-28
• 1.3.1 載體和重復(fù)序列分析25-26
• 1.3.2 序列聚類拼接26-27
• 1.3.3 基因注釋及功能分類27-28
• 1.4 本實(shí)驗(yàn)的目的和意義28-29
• 第二章 鹿茸生長發(fā)育相關(guān)基因的分離克隆29-45
• 2.1 前言29
• 2.2 材料與方法29-37
• 2.2.1 主要試劑29
• 2.2.2 主要儀器29-30
• 2.2.3 樣品采集30
• 2.2.4 m RNA 的提取30-31
• 2.2.5 cDNA-AFLP 分析31-35
• 2.2.6 差異片段的克隆35-37
• 2.3 結(jié)果與分析37-42
• 2.3.1 m RNA 的質(zhì)量檢測(cè)37
• 2.3.2 雙鏈cDNA 的質(zhì)量檢測(cè)37-38
• 2.3.3 酶切結(jié)果38
• 2.3.4 酶切產(chǎn)物的預(yù)擴(kuò)增38-39
• 2.3.5 選擇性擴(kuò)增39
• 2.3.6 聚丙烯酰胺凝膠電泳及銀染39
• 2.3.7 部分差異片段的克隆和測(cè)序39-41
• 2.3.8 RT-PCR 驗(yàn)證41-42
• 2.4 討論42-45
• 第三章 差異表達(dá)基因片段生物信息學(xué)處理及功能分析45-62
• 3.1 前言45
• 3.2 材料與方法45-51
• 3.2.1 去除載體序列45-46
• 3.2.2 去除重復(fù)序列和污染序列46
• 3.2.3 EST 的聚類和拼接46-48
• 3.2.4 EST 數(shù)據(jù)注釋48-50
• 3.2.5 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域和功能位點(diǎn)的預(yù)測(cè)50-51
• 3.2.6 EST 功能分類(gene ontology)51
• 3.3 結(jié)果與分析51-60
• 3.3.1 聚類組裝51-52
• 3.3.2 EST 數(shù)據(jù)注釋52-55
• 3.3.3 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域和功能位點(diǎn)的預(yù)測(cè)55-60
• 3.3.4 EST 的功能分類60
• 3.4 討論60-62
• 第四章 全文總結(jié)62-65
• 4.1 全文討論62-64
• 4.1.1 cDNA-AFLP 技術(shù)與鹿茸發(fā)育相關(guān)特異cDNA 片段的篩選62
• 4.1.2 鹿茸發(fā)育相關(guān)特異cDNA 片段生物信息學(xué)分析62-64
• 4.2 全文結(jié)論64-65
• 參考文獻(xiàn)65-69
• 致謝69-70
• 作者簡歷70-71
• 附錄Ⅰ CDNA-AFLP 銀染結(jié)果71-73
• 附錄Ⅱ EST 序列73-74
• 附錄Ⅲ 生物信息學(xué)分析相關(guān)圖片74-79
• 附錄Ⅳ 試劑配制79

【引證文獻(xiàn)】

中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 孫浩然;鹿茸細(xì)胞端粒酶及其生長相關(guān)蛋白的檢測(cè)與分析[D];吉林大學(xué);2011年

  本文關(guān)鍵詞：鹿茸發(fā)育相關(guān)基因篩選和生物信息學(xué)分析，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號(hào)：363026