【摘要】：研究背景出生缺陷已成為影響我國(guó)人口素質(zhì)和群體健康水平的重要公共衛(wèi)生問(wèn)題。出生缺陷種類(lèi)繁多,先天性心臟病(congenital heart diseases,CHDs)是我國(guó)圍產(chǎn)兒最高發(fā)的畸形,也是導(dǎo)致新生兒及嬰兒死亡的最重要的原因。國(guó)外報(bào)道先心病約占全部重要出生缺陷的1/3,活產(chǎn)兒先心病平均發(fā)病率為9.1‰(95%CI：9.0‰-9.2‰),其中亞洲國(guó)家最高,為9.3‰(95%CI：8.9‰～9.7‰)。我國(guó)2011年的監(jiān)測(cè)報(bào)告顯示CHDs的發(fā)生率為40.95/萬(wàn),并呈逐年增長(zhǎng)的趨勢(shì)。CHDs是指胎兒期心臟及大血管發(fā)育異常而致的心血管畸形。通�？蓪HDs分為三大類(lèi)：紫鉗型心臟病、左側(cè)堵塞性缺陷和隔膜缺陷。臨床上主要的CHDs診斷包括房間隔缺損(：itrial septal defect, ASD)、室間隔缺損(ventricular septal defect, VSD)、動(dòng)脈導(dǎo)管未閉(patent ductus arteriosus, PDA)、法洛氏四聯(lián)癥(tetralogy of Fallot, TOF).大動(dòng)脈轉(zhuǎn)位(transposition of the great arteries, TGA)、肺動(dòng)脈閉鎖(pulmonary valve atresia, PA)、主動(dòng)脈縮窄(coarctation of the aorta, COA)和三尖瓣閉鎖(tricuspid atresia, TA)等。先心病最常見(jiàn)的類(lèi)型是隔膜缺損,其中室間隔缺損(VSD)約占CHDs的20%。因此,進(jìn)一步提高先心病的早期診斷水平、加強(qiáng)病因及其機(jī)制研究、提出科學(xué)的防治措施是降低我國(guó)整體出生缺陷發(fā)病率的保證。微R NA (microRNAs)是一種轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)因子,長(zhǎng)度介于18～22個(gè)核苷酸的單鏈、非編碼的小分子RNA。microRNA已成為當(dāng)前生命科學(xué)領(lǐng)域最受關(guān)注的非編碼調(diào)控RNA,多數(shù)nicroRNA通過(guò)與靶基因3’非翻譯區(qū)(3'Untranslated Region,3'UT R)堿基配對(duì)結(jié)合,在mRNA或蛋白水平抑制基因表達(dá),影響細(xì)胞的生長(zhǎng)、代謝、分化和凋亡,進(jìn)而參與生物體的生長(zhǎng)發(fā)育。microRNA幾乎調(diào)控所有與基因表達(dá)有關(guān)的生物學(xué)過(guò)程。研究發(fā)現(xiàn),microRNA在心血管疾病的發(fā)生與發(fā)展方面發(fā)揮著重要的作用,參與調(diào)控胚胎心臟和血管的發(fā)育,在心臟形態(tài)發(fā)生、心肌細(xì)胞生長(zhǎng)及分化過(guò)程中具有重要的功能。近年來(lái),隨著在血漿中發(fā)現(xiàn)了穩(wěn)定存在的nicroRNA, microRNA的研究聚焦在血漿]microRNA與疾病的關(guān)系上。通過(guò)對(duì)患者和正常人群血漿nicroRNA的檢測(cè)和對(duì)比后,發(fā)現(xiàn)了一批可以用于疾病臨床檢測(cè)的microRNA。作為新的檢測(cè)生物標(biāo)志物,血漿nicroRNA具有方便、快捷以及較高的準(zhǔn)確性等優(yōu)點(diǎn)。目前,由于缺乏針對(duì)先天性心臟病的特異性較高并且較為簡(jiǎn)易的早期檢測(cè)手段,CHDs患兒較難被早期發(fā)現(xiàn)。因此,本研究試圖通過(guò)采用microRNAs表達(dá)譜芯片對(duì)VSD患者血漿microR A表達(dá)進(jìn)行篩選,找出其與正常對(duì)照人群差異表達(dá)的microRNA,并且運(yùn)用RT-PCR技術(shù)對(duì)部分明顯差異表達(dá)的microRNA進(jìn)行檢測(cè),驗(yàn)證芯片結(jié)果的可靠性,尋找可以作為臨床診斷標(biāo)志物的血漿microRNA,評(píng)估其在臨床應(yīng)用中的實(shí)際價(jià)值,構(gòu)建先心病早期診斷模型。運(yùn)用生物信息學(xué)等手段進(jìn)一步對(duì)差異表達(dá)的nicroRNA下游調(diào)控的靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè),分析其生物學(xué)功能,為闡明CHDs在分子水平上的發(fā)病機(jī)制提供線(xiàn)索。CHDs病因復(fù)雜,至今尚未完全明確。一般認(rèn)為CHDs是由遺傳因素和環(huán)境因素共同作用于高度調(diào)節(jié)的心臟發(fā)育過(guò)程而導(dǎo)致。大量的研究表明,人群遺傳背景的基因多態(tài)性可以通過(guò)影響相關(guān)基因的功能,對(duì)疾病易感性發(fā)揮重要的作用。隨著人類(lèi)基因組計(jì)劃的完成,以單核苷酸多態(tài)性(Single Nucleotide Polymorphisms, SNPs)為標(biāo)記進(jìn)行常見(jiàn)復(fù)雜疾病的遺傳易感性研究取得了巨大的進(jìn)展,其中包括候選基因在內(nèi)的關(guān)聯(lián)分析(Candidate gene Association Study)已成為后基因組時(shí)代復(fù)雜疾病遺傳學(xué)研究的熱點(diǎn)之一。因此,結(jié)合中國(guó)山東省先天性心臟病人群病例樣本和相應(yīng)的臨床資料,進(jìn)行SNPs與先心病的關(guān)聯(lián)研究,分析先心病的病因及發(fā)病機(jī)制,發(fā)掘先心病易感的遺傳標(biāo)志,對(duì)提高先心病的預(yù)防和治療水平具有重要的意義。microRNA主要通過(guò)其“種子區(qū)(2-8堿基)”與靶基因mRNA3' UT上的靶序列(target sequence)互補(bǔ)結(jié)合,發(fā)揮其反式作用因子的功能,引起mRNA的翻譯抑制,影響基因表達(dá)劑量。結(jié)合位點(diǎn)的序列決定了microRNA發(fā)揮作用的特異性。靶序列單核苷酸的改變就會(huì)干擾或破壞microRNA與其結(jié)合以及轉(zhuǎn)錄后調(diào)控作用,影響基因的表達(dá)和功能。因此,候選基因3’UTR的]microRNA靶序列SNPs可能會(huì)改變個(gè)體疾病易感性。盡管?chē)?guó)內(nèi)外在基因多態(tài)性和CHDs易感性方面做了大量的研究工作,并鑒定出一些可能致病的多態(tài)位點(diǎn),但不同研究中結(jié)果不一致,且缺乏相關(guān)的分子生物學(xué)功能驗(yàn)證,仍有許多問(wèn)題尚待解決。另外已有研究的基因區(qū)域更多地在基因編碼區(qū),關(guān)注氨基酸變化導(dǎo)致的基因功能異常對(duì)易感性的影響,對(duì)基因非編碼區(qū)尤其nicroRNA靶序列多態(tài)性所導(dǎo)致的基因表達(dá)劑量與CHDs關(guān)系的研究還較少。因此,我們從microRNA對(duì)候選基因3’UTR區(qū)域靶序列結(jié)合的角度,從microRNA差異表達(dá)譜入手,綜合應(yīng)用生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)篩選重點(diǎn)基因靶序列上的功能性SNPs。選擇與絲裂原活化蛋白激酶信號(hào)通路(MAPK signaling pathway)密切相關(guān)的重要轉(zhuǎn)錄因子GATA4作為候選基因,針對(duì)篩選出的靶序列SNPs,應(yīng)用病例-對(duì)照研究方法進(jìn)行相關(guān)SNPs與CHDs的關(guān)聯(lián)分析。在此基礎(chǔ)上,應(yīng)用細(xì)胞和分子生物學(xué)方法對(duì)CHDs有關(guān)聯(lián)的SNPs進(jìn)行功能學(xué)實(shí)驗(yàn),分析多態(tài)介導(dǎo)的microRNA通過(guò)GATA4表達(dá)調(diào)控引起CHDs發(fā)生的可能分子機(jī)制。通過(guò)上述研究提出相應(yīng)的CHDs預(yù)防策略和措施,爭(zhēng)取能進(jìn)一步將CHDs的出生缺陷預(yù)警提前到圍產(chǎn)期甚至更早,為我國(guó)優(yōu)生優(yōu)育政策的制定提供依據(jù)。研究目的1.篩選并驗(yàn)證室間隔缺損患者血漿中表達(dá)差異的microRNA;評(píng)價(jià)血漿microR NA在先心病早期診斷中的臨床應(yīng)用價(jià)值以及作為先心病分子診斷標(biāo)志物的可行性,建立臨床早期診斷模型。2.結(jié)合生物信息學(xué)技術(shù)對(duì)差異表達(dá)的]microRNA進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)以及功能注釋和pathway注釋,構(gòu)建microRNA與基因的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)；篩選先心病相關(guān)基因的microRNA靶序列中功能性SNPs及其參與調(diào)控的microRNA,為開(kāi)展系統(tǒng)性的microRNA靶序列與先心病的關(guān)聯(lián)研究以及機(jī)制分析提供參考。3.研究GATA4基因3’UTR靶序列的8個(gè)功能性SNPs與先心病人群易感性的關(guān)聯(lián)；采用熒光素酶報(bào)告基因功能實(shí)驗(yàn)檢驗(yàn)S NP rs3203358 (1521 C G)影響miR-583對(duì)GATA4基因的結(jié)合和表達(dá)調(diào)控,分析多態(tài)介導(dǎo)的microRNA調(diào)控靶基因引起先心病發(fā)生的可能機(jī)制。研究方法1.研究對(duì)象采用以醫(yī)院為基礎(chǔ)的病例-對(duì)照研究方法開(kāi)展本次研究。于2012年6月-2013年11月分別在濟(jì)南市兒童醫(yī)院和泰安市婦幼保健院心血管外科收集就診和治療的0.4-6歲先天性心臟病患者作為病例組；并同期于上述醫(yī)院查體中心收集查體兒童作為對(duì)照組。所有研究對(duì)象出生地均為山東省。本研究通過(guò)了相關(guān)醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。1)血漿microRNA差異表達(dá)譜檢測(cè)：共收集病例組85例和對(duì)照組80例,分三個(gè)階段進(jìn)行檢測(cè)：首先選擇室間隔缺損(VSD)病例及其匹配對(duì)照各3例,應(yīng)用microRNA全基因組表達(dá)譜芯片進(jìn)行初篩；然后擴(kuò)大樣本量(20例病例vs 15例對(duì)照)對(duì)選定的8個(gè)差異microRNA使用實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(real-time quantitative PCR, qRT-PCR)進(jìn)行芯片結(jié)果的驗(yàn)證；最后進(jìn)一步擴(kuò)大樣本(62例 vs62例)進(jìn)行qRT-PCR測(cè)定,篩選先心病早期診斷的生物標(biāo)志物。2)GATA4基因microRNA靶序列SNPs與先心病的關(guān)聯(lián)研究：參考估計(jì)的樣本含量,選取309例先心病病例和408例對(duì)照進(jìn)行基因型檢測(cè),研究GATA4基因3’UTR靶序列的SNPs與CHDs易感性關(guān)聯(lián)。2.樣本采集于入院次日清晨空腹采集研究對(duì)象靜脈血標(biāo)本4ml,其中2ml裝入EDTA抗凝管,保存于-20℃冰箱中,一周內(nèi)用酚-氯仿法提取基因組DNA。另外2ml外周血4000rpm離心10分鐘,吸取上清,按每管100ul分裝,置于-80℃保存?zhèn)溆谩?.microRNA全基因組表達(dá)譜芯片篩選采用7th generation of miRCURYTM LNA Array (v.18.0) (Exiqon, Vedbaek, Denmai k)全基因組表達(dá)譜芯片技術(shù),將3對(duì)血漿標(biāo)本委托上海康成生物工程有限公司進(jìn)行nicroRNA芯片檢測(cè)。應(yīng)用GenePix Pro 6.0 software (Axon)分析表達(dá)譜芯片結(jié)果,列出與對(duì)照組相比,表達(dá)上調(diào)或下調(diào)大于1.5倍且有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)的microRNA,作為候選的血漿microR NA差異表達(dá)譜。4.實(shí)時(shí)定量PCR驗(yàn)證抽提血漿總RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA后,以miR-93為內(nèi)參照,各樣品的目的nicroRNA和內(nèi)參(miR-93)分別進(jìn)行Realtime PCR反應(yīng)。數(shù)據(jù)采用2-△△CT法進(jìn)行分析。5.診斷模型的建立和評(píng)價(jià)選擇8個(gè)重要差異表達(dá)的microRNA,利用124例樣本的RT-PCR檢測(cè)數(shù)據(jù)對(duì)比表達(dá)差異獲得具有臨床診斷意義的血漿microRNA,建立多指標(biāo)的logistic回歸模型。應(yīng)用MedCalc軟件進(jìn)行ROC曲線(xiàn)分析評(píng)價(jià)診斷模型的價(jià)值。6.靶基因分析和靶序列SNPs篩選運(yùn)用生物信息學(xué)分析方法對(duì)microRNA差異表達(dá)譜進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)、聚類(lèi)分析。基于Gene Ontology(GO)和KEGG數(shù)據(jù)庫(kù),對(duì)靶基因進(jìn)行功能注釋以及Pathway注釋。利用Cytoscape2.8.3軟件構(gòu)建microRNA與靶基因的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。通過(guò)分階段數(shù)據(jù)挖掘進(jìn)行候選基因microRNA靶序列功能性SNPs及參與調(diào)控的microRNA的分析和篩選。7.GATA4基因3’UTR區(qū)域靶序列SNPs檢測(cè)利用Sanger雙脫氧氫測(cè)序技術(shù)(Sanger dideoxy sequencing technology of hydrogen)對(duì)GATA4基因3’UTR區(qū)域8 個(gè) SNPs位點(diǎn)(rs867858、rs1062219、 rs884662、rs904018、rs12825、rs12458、rs1062270和rs3203358)進(jìn)行病例組和對(duì)照組的基因型檢測(cè),采用χ2檢驗(yàn)分別比較不同基因型及等位基因頻率,以非條件Logistic回歸模型計(jì)算比值比(OR)及其95%可信區(qū)間(95%Cl),分析各靶序列SNPs與CHDs及各臨床類(lèi)型發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)之間的關(guān)聯(lián),并進(jìn)行連鎖不平衡和單倍型分析。8.雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)構(gòu)建pMIR-GATA4野生型和突變型(rs3203358,1521 CG)重組表達(dá)質(zhì)粒以及miR-583 mimic,共轉(zhuǎn)染人源胚胎腎細(xì)胞(Human Embryonic Kidney 293 cell, HEK-293)培養(yǎng)后,運(yùn)用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒檢測(cè)熒光強(qiáng)度,檢驗(yàn)miR-583與GATA4不同等位基因型3’UTR重組質(zhì)粒結(jié)合情況,分析miR-583是否通過(guò)該突變位點(diǎn)影響GATA4基因的表達(dá)活性。研究結(jié)果1.先心病患者血漿差異nicroRNA s篩選及驗(yàn)證利用miRCURYTM LNA Array (v.18.0) micro RNA芯片技術(shù)檢測(cè)了3例室間隔缺損(VSD)患者和3例健康對(duì)照血漿中的microRNA表達(dá)特征,初步確定了VSD差異microRNA表達(dá)譜。芯片雜交初篩結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比,有36個(gè)表達(dá)差異的microRNA(P0.05),其中21個(gè)microRNA在VSD患者表達(dá)顯著下調(diào),表達(dá)顯著上調(diào)的microRNA有15個(gè)。選擇出8個(gè)重要的差異表達(dá)microRNA進(jìn)行隨后的兩階段大樣本qRT-PCR驗(yàn)證,檢測(cè)到5種血漿nicroRNA(let-7e-5p、 miR-155-5p、miR-222-3p、miR-433 和 miR-487b)在VSD中的表達(dá)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,可以選擇作為具有VSD早期診斷意義的生物標(biāo)志物。2.先心病血漿microRNA診斷模型及其評(píng)價(jià)采用ROC曲線(xiàn)(受試者工作特征曲線(xiàn),receiver operating characteristic curve)分析5種血漿microRNA(let-7e-5p、miR-155-5p、miR-222-3p.miR-433 和 miR-487b)表達(dá)水平對(duì)于VSD的診斷效率。上述5種血漿microRNA的ROC曲線(xiàn)下面積(Area Under Curve, AUC)分別在0.678至0.832之間,其中miR-222-3p的ROC曲線(xiàn)下面積最大為0.7832。建立多指標(biāo)Logistic回歸分析模型,5種血漿microRNAs聯(lián)合模型可提高VSD的診斷效率,ROC曲線(xiàn)下面積達(dá)到0.953,靈敏度及特異度分別為0.839和0.952；3種血漿microRNA(let-7e-5p、miR-155-5p、 miR-222-3p)聯(lián)合診斷模型,ROC曲線(xiàn)下面積達(dá)到0.910,靈敏度及特異度分別為0.823和0.903。3.差異nicroRNAs靶基因預(yù)測(cè)應(yīng)用niRBase、miRanda和 TargetScan三個(gè)靶基因預(yù)測(cè)軟件對(duì)病例組和對(duì)照組表達(dá)差異的36個(gè)microRNAs靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)。合并三個(gè)預(yù)測(cè)數(shù)據(jù)庫(kù)的交集,得到15個(gè)先心病差異表達(dá)microRNAs的447個(gè)預(yù)測(cè)靶基因,差異microRNAs的靶基因中含有與心臟發(fā)育密切相關(guān)的關(guān)鍵基因(HAND1、NKX2-4、TBX-1、 MAP2K4、GATA4、NOTCH1、ZFPM2等)。4.靶基因GO/Pathway分析及篩選microRNA靶序列SNPs基因本體(Gene Ontology, GO)分析對(duì)靶基因進(jìn)行功能注釋,顯示先心病差異表達(dá)microRNA調(diào)控的靶基因涉及多方面的功能,其中富集度(Fold Enrichment)最高的生物學(xué)過(guò)程相關(guān)功能條目為心臟右心室形態(tài)發(fā)生(cardiac right ventricle morphogenesis),相關(guān)靶基因?yàn)镹OTCH1、HAND1、ZFPM2、GATA3,調(diào)控這4個(gè)靶基因的nicroRNA為let-7e-5p、miR-222-3p和 miR-433,在先心病患者血漿中表達(dá)均下調(diào)(P0.05)。KEGG pathway分析獲得靶基因與差異microRNAs的顯著性調(diào)控通路(P0.05),多數(shù)通路與心臟發(fā)育、腫瘤發(fā)生、出生缺陷、以及新生兒生長(zhǎng)發(fā)育或心血管疾病有關(guān),關(guān)注與MAPK通路有關(guān)的心臟發(fā)育重要的轉(zhuǎn)錄因子GATA4。對(duì)靶基因通過(guò)顯著性功能分析,構(gòu)建microRNA與靶基因的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。篩選出3個(gè)核心基因(NOTCH1/GATA3/GATA4)靶序列的11個(gè)功能性SNPs及23個(gè)可能參與調(diào)控的microRNA,作為研究先心病人群易感性關(guān)聯(lián)及其發(fā)生機(jī)制的參考。5.GATA4基因3’UTR靶位點(diǎn)SNPs與CHDs易感性關(guān)聯(lián)選擇GATA4基因lnicroRNA靶序列中的8個(gè)位點(diǎn)SNPs進(jìn)行基因型檢測(cè)對(duì)比分析。有6個(gè)位點(diǎn)(rs867858A C、rs884662TC、rs904018TC、rs12825 C G、rs12458AT、和rs3203358C G)的等位基因或基因型分布頻率差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),與先心病易感性有關(guān)聯(lián)。rs867858A C位點(diǎn)中,C等位基因的OR為1.498(95%CI:1.209-1.857), A/C和C/C基因型分別是A/A基因型患病風(fēng)險(xiǎn)的1.428倍(OR=1.428,95%CI:1.028-1.982)和2.496倍(OR=2.496,95%C7: 1.553-0.672); rs884662TC位點(diǎn)中,C等位基因的OR為2.124(95%C7: 1.615-2.794), T/C和C/C基因型分別是T/T基因型患病風(fēng)險(xiǎn)的1.70倍(OR=1.70,95%CI:1.200-2.409)和4.628倍(OR=4.628,95%CI:2.273-9.423); rs904018TC位點(diǎn)中,C等位基因的OR為0.481(95%CI：0.387-0.599),T/C和C/C基因型者分別是T/T基因型患病風(fēng)險(xiǎn)的0.529倍(95%CI:0.338-0.827)和0.261倍(95%CI：0.166-0.412)；rs12825 CG位點(diǎn)中,G等位基因的OR為0.770(95%CI：0.620-0.956), C/G和G/G基因型與CHDs的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)可能無(wú)關(guān)(OR=0.950,95%CI：0.605-1.492, P=0.824)、(OR=0.645,95%CI:0.406-1.025, P=0.062); rs12458AT位點(diǎn)中,T等位基因的OR為0.679(95%CI：0.549-0.840),A/T和T/T基因型分別是AA基因型患病風(fēng)險(xiǎn)的0.612倍(95%CI：0.396-0.939)和0.423倍(95%CI：0.266-0.672)；rs3203358CG位點(diǎn)中,G等位基因的OR為0.673(95%CI：0.527-0.860),C/G和G/G基因型分別是C/C基因型患病風(fēng)險(xiǎn)的0.699倍(95%CI：0.508-0.962)和0.469倍(95%CI:0.257-0.854)。各標(biāo)簽SNPs與先心病不同臨床類(lèi)型的關(guān)聯(lián)強(qiáng)度有一些差異,總的關(guān)聯(lián)模式與總類(lèi)結(jié)果比較一致。6.連鎖不平衡分析以及單倍型分析遺傳標(biāo)記位點(diǎn)間的連鎖不平衡分析結(jié)果表明,rs12458-rs12825-rs867858之間存在緊密連鎖(D’為0.81～0.94)、rs904018-rs3203358之間也存在緊密連鎖(D’為0.95)。Haploview軟件分析顯示,rs867858、rs904018和rs884662位點(diǎn)為標(biāo)簽SNPs (Tag SNPs)。這3個(gè)標(biāo)簽SNPs(排列順序?yàn)閞s867858、rs884662、rs904018)的單倍型分析顯示,ATC單倍型(OR=0.581,95%CI：0.567-0.986)和CCT單倍型(OR=3.698,95%CI:2.500-5.471)在CHDs組與對(duì)照組間的頻率具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。其中,ATC單倍型為保護(hù)性單倍型,CCT單倍型是CHDs的風(fēng)險(xiǎn)性單倍型。7.SNPs rs3203358影響miR-583對(duì)GATA4的表達(dá)調(diào)控通過(guò)構(gòu)建SNPs rs3203358C/G不同基因型GATA4-3' UTR表達(dá)載體,采用熒光素酶報(bào)告基因的方法研究發(fā)現(xiàn),miR-583可以顯著降低野生型C等位基因的熒光素酶活性,而對(duì)突變型G等位基因的熒光素酶活性沒(méi)有影響。該多態(tài)由CG的變化,逃逸了niR-583對(duì)GATA4的負(fù)調(diào)控,使基因相對(duì)高表達(dá)。結(jié)論1.通過(guò)microRNA表達(dá)譜芯片篩選及兩階段擴(kuò)大樣本的qRT-PCR驗(yàn)證,得到了5種血漿差異表達(dá)的microRNA(let-7e-5p、miR-155-5p、miR-222-3p、miR-433和miR-487b)可作為室間隔缺損診斷標(biāo)志物。構(gòu)建microRNA多指標(biāo)Logisit ic回歸分析模型,ROC曲線(xiàn)分析顯示,3種血漿microRNA(miR-let-7e、2miR-155-5p、 miR-222-3 P)聯(lián)合診斷模型的價(jià)值近似于5種nicroRNA的聯(lián)合,可顯著提高先心病的診斷效率,并具有臨床應(yīng)用的可行性。2.生物信息學(xué)分析預(yù)測(cè)得出差異表達(dá)microRNAs與先心病發(fā)生相關(guān)的靶基因,以及靶基因中可能參與調(diào)控的多條信號(hào)通路。microRNAs可能通過(guò)與多個(gè)靶基因的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)來(lái)影響心臟發(fā)育和先心病的形成。篩選出的3個(gè)核心基因(NOTCH1/GATA3/GATA4)靶序列的11個(gè)功能性SNPs可能會(huì)影響23種microRNA對(duì)靶基因的結(jié)合和表達(dá)調(diào)控,可作為深入研究的分子標(biāo)志物參考。3.GATA4基因6個(gè)microRNA靶位點(diǎn)多態(tài)性與CHDs有關(guān)聯(lián)。rs867858位點(diǎn)A/C、C/C基因型、C等位基因以及rs884662位點(diǎn)T/C、C/C基因型、C等位基因可能會(huì)增加CHDs發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)；rs904018位點(diǎn)/C、C/C基因型、C等位基因,rs12458位點(diǎn)A/T、T/T基因型、T等位基因,rs3203358位點(diǎn)C/G. G/G基因型、G等位基因,rs12825 G等位基因可能會(huì)降低CHDs發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。3個(gè)標(biāo)簽SNPs綜合分析表明,ATC單倍型為保護(hù)性單倍型,CCT單倍型為風(fēng)險(xiǎn)性單倍型。4.成功構(gòu)建和鑒定攜帶目的基因片段的pMIR-GATA4的重組質(zhì)粒,并通過(guò)熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)初步驗(yàn)證了GATA4基因3' UTR rs3203358 (1521 CG)可能是miR-583的靶位點(diǎn),miR-583可能通過(guò)該多態(tài)位點(diǎn)的結(jié)合來(lái)調(diào)控GATA4基因的表達(dá)水平,進(jìn)而影響先心病的易感性。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：R725.4

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前3條

1 張程;鐘詩(shī)龍;張智偉;;先天性心臟病繼發(fā)性肺動(dòng)脈高壓患者血漿中miRNA的研究[J];嶺南心血管病雜志;2014年04期

2 余章斌;韓樹(shù)萍;朱春;董小s

本文編號(hào)：2773731