【摘要】：研究背景出生缺陷已成為影響我國人口素質(zhì)和群體健康水平的重要公共衛(wèi)生問題。出生缺陷種類繁多,先天性心臟病(congenital heart diseases,CHDs)是我國圍產(chǎn)兒最高發(fā)的畸形,也是導(dǎo)致新生兒及嬰兒死亡的最重要的原因。國外報道先心病約占全部重要出生缺陷的1/3,活產(chǎn)兒先心病平均發(fā)病率為9.1‰(95%CI：9.0‰-9.2‰),其中亞洲國家最高,為9.3‰(95%CI：8.9‰～9.7‰)。我國2011年的監(jiān)測報告顯示CHDs的發(fā)生率為40.95/萬,并呈逐年增長的趨勢。CHDs是指胎兒期心臟及大血管發(fā)育異常而致的心血管畸形。通�？蓪HDs分為三大類：紫鉗型心臟病、左側(cè)堵塞性缺陷和隔膜缺陷。臨床上主要的CHDs診斷包括房間隔缺損(：itrial septal defect, ASD)、室間隔缺損(ventricular septal defect, VSD)、動脈導(dǎo)管未閉(patent ductus arteriosus, PDA)、法洛氏四聯(lián)癥(tetralogy of Fallot, TOF).大動脈轉(zhuǎn)位(transposition of the great arteries, TGA)、肺動脈閉鎖(pulmonary valve atresia, PA)、主動脈縮窄(coarctation of the aorta, COA)和三尖瓣閉鎖(tricuspid atresia, TA)等。先心病最常見的類型是隔膜缺損,其中室間隔缺損(VSD)約占CHDs的20%。因此,進一步提高先心病的早期診斷水平、加強病因及其機制研究、提出科學(xué)的防治措施是降低我國整體出生缺陷發(fā)病率的保證。微R NA (microRNAs)是一種轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)因子,長度介于18～22個核苷酸的單鏈、非編碼的小分子RNA。microRNA已成為當(dāng)前生命科學(xué)領(lǐng)域最受關(guān)注的非編碼調(diào)控RNA,多數(shù)nicroRNA通過與靶基因3’非翻譯區(qū)(3'Untranslated Region,3'UT R)堿基配對結(jié)合,在mRNA或蛋白水平抑制基因表達,影響細胞的生長、代謝、分化和凋亡,進而參與生物體的生長發(fā)育。microRNA幾乎調(diào)控所有與基因表達有關(guān)的生物學(xué)過程。研究發(fā)現(xiàn),microRNA在心血管疾病的發(fā)生與發(fā)展方面發(fā)揮著重要的作用,參與調(diào)控胚胎心臟和血管的發(fā)育,在心臟形態(tài)發(fā)生、心肌細胞生長及分化過程中具有重要的功能。近年來,隨著在血漿中發(fā)現(xiàn)了穩(wěn)定存在的nicroRNA, microRNA的研究聚焦在血漿]microRNA與疾病的關(guān)系上。通過對患者和正常人群血漿nicroRNA的檢測和對比后,發(fā)現(xiàn)了一批可以用于疾病臨床檢測的microRNA。作為新的檢測生物標(biāo)志物,血漿nicroRNA具有方便、快捷以及較高的準(zhǔn)確性等優(yōu)點。目前,由于缺乏針對先天性心臟病的特異性較高并且較為簡易的早期檢測手段,CHDs患兒較難被早期發(fā)現(xiàn)。因此,本研究試圖通過采用microRNAs表達譜芯片對VSD患者血漿microR A表達進行篩選,找出其與正常對照人群差異表達的microRNA,并且運用RT-PCR技術(shù)對部分明顯差異表達的microRNA進行檢測,驗證芯片結(jié)果的可靠性,尋找可以作為臨床診斷標(biāo)志物的血漿microRNA,評估其在臨床應(yīng)用中的實際價值,構(gòu)建先心病早期診斷模型。運用生物信息學(xué)等手段進一步對差異表達的nicroRNA下游調(diào)控的靶基因進行預(yù)測,分析其生物學(xué)功能,為闡明CHDs在分子水平上的發(fā)病機制提供線索。CHDs病因復(fù)雜,至今尚未完全明確。一般認為CHDs是由遺傳因素和環(huán)境因素共同作用于高度調(diào)節(jié)的心臟發(fā)育過程而導(dǎo)致。大量的研究表明,人群遺傳背景的基因多態(tài)性可以通過影響相關(guān)基因的功能,對疾病易感性發(fā)揮重要的作用。隨著人類基因組計劃的完成,以單核苷酸多態(tài)性(Single Nucleotide Polymorphisms, SNPs)為標(biāo)記進行常見復(fù)雜疾病的遺傳易感性研究取得了巨大的進展,其中包括候選基因在內(nèi)的關(guān)聯(lián)分析(Candidate gene Association Study)已成為后基因組時代復(fù)雜疾病遺傳學(xué)研究的熱點之一。因此,結(jié)合中國山東省先天性心臟病人群病例樣本和相應(yīng)的臨床資料,進行SNPs與先心病的關(guān)聯(lián)研究,分析先心病的病因及發(fā)病機制,發(fā)掘先心病易感的遺傳標(biāo)志,對提高先心病的預(yù)防和治療水平具有重要的意義。microRNA主要通過其“種子區(qū)(2-8堿基)”與靶基因mRNA3' UT上的靶序列(target sequence)互補結(jié)合,發(fā)揮其反式作用因子的功能,引起mRNA的翻譯抑制,影響基因表達劑量。結(jié)合位點的序列決定了microRNA發(fā)揮作用的特異性。靶序列單核苷酸的改變就會干擾或破壞microRNA與其結(jié)合以及轉(zhuǎn)錄后調(diào)控作用,影響基因的表達和功能。因此,候選基因3’UTR的]microRNA靶序列SNPs可能會改變個體疾病易感性。盡管國內(nèi)外在基因多態(tài)性和CHDs易感性方面做了大量的研究工作,并鑒定出一些可能致病的多態(tài)位點,但不同研究中結(jié)果不一致,且缺乏相關(guān)的分子生物學(xué)功能驗證,仍有許多問題尚待解決。另外已有研究的基因區(qū)域更多地在基因編碼區(qū),關(guān)注氨基酸變化導(dǎo)致的基因功能異常對易感性的影響,對基因非編碼區(qū)尤其nicroRNA靶序列多態(tài)性所導(dǎo)致的基因表達劑量與CHDs關(guān)系的研究還較少。因此,我們從microRNA對候選基因3’UTR區(qū)域靶序列結(jié)合的角度,從microRNA差異表達譜入手,綜合應(yīng)用生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫篩選重點基因靶序列上的功能性SNPs。選擇與絲裂原活化蛋白激酶信號通路(MAPK signaling pathway)密切相關(guān)的重要轉(zhuǎn)錄因子GATA4作為候選基因,針對篩選出的靶序列SNPs,應(yīng)用病例-對照研究方法進行相關(guān)SNPs與CHDs的關(guān)聯(lián)分析。在此基礎(chǔ)上,應(yīng)用細胞和分子生物學(xué)方法對CHDs有關(guān)聯(lián)的SNPs進行功能學(xué)實驗,分析多態(tài)介導(dǎo)的microRNA通過GATA4表達調(diào)控引起CHDs發(fā)生的可能分子機制。通過上述研究提出相應(yīng)的CHDs預(yù)防策略和措施,爭取能進一步將CHDs的出生缺陷預(yù)警提前到圍產(chǎn)期甚至更早,為我國優(yōu)生優(yōu)育政策的制定提供依據(jù)。研究目的1.篩選并驗證室間隔缺損患者血漿中表達差異的microRNA;評價血漿microR NA在先心病早期診斷中的臨床應(yīng)用價值以及作為先心病分子診斷標(biāo)志物的可行性,建立臨床早期診斷模型。2.結(jié)合生物信息學(xué)技術(shù)對差異表達的]microRNA進行靶基因預(yù)測以及功能注釋和pathway注釋,構(gòu)建microRNA與基因的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)；篩選先心病相關(guān)基因的microRNA靶序列中功能性SNPs及其參與調(diào)控的microRNA,為開展系統(tǒng)性的microRNA靶序列與先心病的關(guān)聯(lián)研究以及機制分析提供參考。3.研究GATA4基因3’UTR靶序列的8個功能性SNPs與先心病人群易感性的關(guān)聯(lián)；采用熒光素酶報告基因功能實驗檢驗S NP rs3203358 (1521 C G)影響miR-583對GATA4基因的結(jié)合和表達調(diào)控,分析多態(tài)介導(dǎo)的microRNA調(diào)控靶基因引起先心病發(fā)生的可能機制。研究方法1.研究對象采用以醫(yī)院為基礎(chǔ)的病例-對照研究方法開展本次研究。于2012年6月-2013年11月分別在濟南市兒童醫(yī)院和泰安市婦幼保健院心血管外科收集就診和治療的0.4-6歲先天性心臟病患者作為病例組；并同期于上述醫(yī)院查體中心收集查體兒童作為對照組。所有研究對象出生地均為山東省。本研究通過了相關(guān)醫(yī)院倫理委員會的批準(zhǔn)。1)血漿microRNA差異表達譜檢測：共收集病例組85例和對照組80例,分三個階段進行檢測：首先選擇室間隔缺損(VSD)病例及其匹配對照各3例,應(yīng)用microRNA全基因組表達譜芯片進行初篩；然后擴大樣本量(20例病例vs 15例對照)對選定的8個差異microRNA使用實時定量聚合酶鏈反應(yīng)(real-time quantitative PCR, qRT-PCR)進行芯片結(jié)果的驗證；最后進一步擴大樣本(62例 vs62例)進行qRT-PCR測定,篩選先心病早期診斷的生物標(biāo)志物。2)GATA4基因microRNA靶序列SNPs與先心病的關(guān)聯(lián)研究：參考估計的樣本含量,選取309例先心病病例和408例對照進行基因型檢測,研究GATA4基因3’UTR靶序列的SNPs與CHDs易感性關(guān)聯(lián)。2.樣本采集于入院次日清晨空腹采集研究對象靜脈血標(biāo)本4ml,其中2ml裝入EDTA抗凝管,保存于-20℃冰箱中,一周內(nèi)用酚-氯仿法提取基因組DNA。另外2ml外周血4000rpm離心10分鐘,吸取上清,按每管100ul分裝,置于-80℃保存?zhèn)溆谩?.microRNA全基因組表達譜芯片篩選采用7th generation of miRCURYTM LNA Array (v.18.0) (Exiqon, Vedbaek, Denmai k)全基因組表達譜芯片技術(shù),將3對血漿標(biāo)本委托上�？党缮锕こ逃邢薰具M行nicroRNA芯片檢測。應(yīng)用GenePix Pro 6.0 software (Axon)分析表達譜芯片結(jié)果,列出與對照組相比,表達上調(diào)或下調(diào)大于1.5倍且有統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)的microRNA,作為候選的血漿microR NA差異表達譜。4.實時定量PCR驗證抽提血漿總RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA后,以miR-93為內(nèi)參照,各樣品的目的nicroRNA和內(nèi)參(miR-93)分別進行Realtime PCR反應(yīng)。數(shù)據(jù)采用2-△△CT法進行分析。5.診斷模型的建立和評價選擇8個重要差異表達的microRNA,利用124例樣本的RT-PCR檢測數(shù)據(jù)對比表達差異獲得具有臨床診斷意義的血漿microRNA,建立多指標(biāo)的logistic回歸模型。應(yīng)用MedCalc軟件進行ROC曲線分析評價診斷模型的價值。6.靶基因分析和靶序列SNPs篩選運用生物信息學(xué)分析方法對microRNA差異表達譜進行靶基因預(yù)測、聚類分析�；贕ene Ontology(GO)和KEGG數(shù)據(jù)庫,對靶基因進行功能注釋以及Pathway注釋。利用Cytoscape2.8.3軟件構(gòu)建microRNA與靶基因的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。通過分階段數(shù)據(jù)挖掘進行候選基因microRNA靶序列功能性SNPs及參與調(diào)控的microRNA的分析和篩選。7.GATA4基因3’UTR區(qū)域靶序列SNPs檢測利用Sanger雙脫氧氫測序技術(shù)(Sanger dideoxy sequencing technology of hydrogen)對GATA4基因3’UTR區(qū)域8 個 SNPs位點(rs867858、rs1062219、 rs884662、rs904018、rs12825、rs12458、rs1062270和rs3203358)進行病例組和對照組的基因型檢測,采用χ2檢驗分別比較不同基因型及等位基因頻率,以非條件Logistic回歸模型計算比值比(OR)及其95%可信區(qū)間(95%Cl),分析各靶序列SNPs與CHDs及各臨床類型發(fā)病風(fēng)險之間的關(guān)聯(lián),并進行連鎖不平衡和單倍型分析。8.雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灅?gòu)建pMIR-GATA4野生型和突變型(rs3203358,1521 CG)重組表達質(zhì)粒以及miR-583 mimic,共轉(zhuǎn)染人源胚胎腎細胞(Human Embryonic Kidney 293 cell, HEK-293)培養(yǎng)后,運用雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒檢測熒光強度,檢驗miR-583與GATA4不同等位基因型3’UTR重組質(zhì)粒結(jié)合情況,分析miR-583是否通過該突變位點影響GATA4基因的表達活性。研究結(jié)果1.先心病患者血漿差異nicroRNA s篩選及驗證利用miRCURYTM LNA Array (v.18.0) micro RNA芯片技術(shù)檢測了3例室間隔缺損(VSD)患者和3例健康對照血漿中的microRNA表達特征,初步確定了VSD差異microRNA表達譜。芯片雜交初篩結(jié)果顯示：與對照組相比,有36個表達差異的microRNA(P0.05),其中21個microRNA在VSD患者表達顯著下調(diào),表達顯著上調(diào)的microRNA有15個。選擇出8個重要的差異表達microRNA進行隨后的兩階段大樣本qRT-PCR驗證,檢測到5種血漿nicroRNA(let-7e-5p、 miR-155-5p、miR-222-3p、miR-433 和 miR-487b)在VSD中的表達差異具有統(tǒng)計學(xué)意義,可以選擇作為具有VSD早期診斷意義的生物標(biāo)志物。2.先心病血漿microRNA診斷模型及其評價采用ROC曲線(受試者工作特征曲線,receiver operating characteristic curve)分析5種血漿microRNA(let-7e-5p、miR-155-5p、miR-222-3p.miR-433 和 miR-487b)表達水平對于VSD的診斷效率。上述5種血漿microRNA的ROC曲線下面積(Area Under Curve, AUC)分別在0.678至0.832之間,其中miR-222-3p的ROC曲線下面積最大為0.7832。建立多指標(biāo)Logistic回歸分析模型,5種血漿microRNAs聯(lián)合模型可提高VSD的診斷效率,ROC曲線下面積達到0.953,靈敏度及特異度分別為0.839和0.952；3種血漿microRNA(let-7e-5p、miR-155-5p、 miR-222-3p)聯(lián)合診斷模型,ROC曲線下面積達到0.910,靈敏度及特異度分別為0.823和0.903。3.差異nicroRNAs靶基因預(yù)測應(yīng)用niRBase、miRanda和 TargetScan三個靶基因預(yù)測軟件對病例組和對照組表達差異的36個microRNAs靶基因進行預(yù)測。合并三個預(yù)測數(shù)據(jù)庫的交集,得到15個先心病差異表達microRNAs的447個預(yù)測靶基因,差異microRNAs的靶基因中含有與心臟發(fā)育密切相關(guān)的關(guān)鍵基因(HAND1、NKX2-4、TBX-1、 MAP2K4、GATA4、NOTCH1、ZFPM2等)。4.靶基因GO/Pathway分析及篩選microRNA靶序列SNPs基因本體(Gene Ontology, GO)分析對靶基因進行功能注釋,顯示先心病差異表達microRNA調(diào)控的靶基因涉及多方面的功能,其中富集度(Fold Enrichment)最高的生物學(xué)過程相關(guān)功能條目為心臟右心室形態(tài)發(fā)生(cardiac right ventricle morphogenesis),相關(guān)靶基因為NOTCH1、HAND1、ZFPM2、GATA3,調(diào)控這4個靶基因的nicroRNA為let-7e-5p、miR-222-3p和 miR-433,在先心病患者血漿中表達均下調(diào)(P0.05)。KEGG pathway分析獲得靶基因與差異microRNAs的顯著性調(diào)控通路(P0.05),多數(shù)通路與心臟發(fā)育、腫瘤發(fā)生、出生缺陷、以及新生兒生長發(fā)育或心血管疾病有關(guān),關(guān)注與MAPK通路有關(guān)的心臟發(fā)育重要的轉(zhuǎn)錄因子GATA4。對靶基因通過顯著性功能分析,構(gòu)建microRNA與靶基因的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。篩選出3個核心基因(NOTCH1/GATA3/GATA4)靶序列的11個功能性SNPs及23個可能參與調(diào)控的microRNA,作為研究先心病人群易感性關(guān)聯(lián)及其發(fā)生機制的參考。5.GATA4基因3’UTR靶位點SNPs與CHDs易感性關(guān)聯(lián)選擇GATA4基因lnicroRNA靶序列中的8個位點SNPs進行基因型檢測對比分析。有6個位點(rs867858A C、rs884662TC、rs904018TC、rs12825 C G、rs12458AT、和rs3203358C G)的等位基因或基因型分布頻率差異存在統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),與先心病易感性有關(guān)聯(lián)。rs867858A C位點中,C等位基因的OR為1.498(95%CI:1.209-1.857), A/C和C/C基因型分別是A/A基因型患病風(fēng)險的1.428倍(OR=1.428,95%CI:1.028-1.982)和2.496倍(OR=2.496,95%C7: 1.553-0.672); rs884662TC位點中,C等位基因的OR為2.124(95%C7: 1.615-2.794), T/C和C/C基因型分別是T/T基因型患病風(fēng)險的1.70倍(OR=1.70,95%CI:1.200-2.409)和4.628倍(OR=4.628,95%CI:2.273-9.423); rs904018TC位點中,C等位基因的OR為0.481(95%CI：0.387-0.599),T/C和C/C基因型者分別是T/T基因型患病風(fēng)險的0.529倍(95%CI:0.338-0.827)和0.261倍(95%CI：0.166-0.412)；rs12825 CG位點中,G等位基因的OR為0.770(95%CI：0.620-0.956), C/G和G/G基因型與CHDs的發(fā)生風(fēng)險可能無關(guān)(OR=0.950,95%CI：0.605-1.492, P=0.824)、(OR=0.645,95%CI:0.406-1.025, P=0.062); rs12458AT位點中,T等位基因的OR為0.679(95%CI：0.549-0.840),A/T和T/T基因型分別是AA基因型患病風(fēng)險的0.612倍(95%CI：0.396-0.939)和0.423倍(95%CI：0.266-0.672)；rs3203358CG位點中,G等位基因的OR為0.673(95%CI：0.527-0.860),C/G和G/G基因型分別是C/C基因型患病風(fēng)險的0.699倍(95%CI：0.508-0.962)和0.469倍(95%CI:0.257-0.854)。各標(biāo)簽SNPs與先心病不同臨床類型的關(guān)聯(lián)強度有一些差異,總的關(guān)聯(lián)模式與總類結(jié)果比較一致。6.連鎖不平衡分析以及單倍型分析遺傳標(biāo)記位點間的連鎖不平衡分析結(jié)果表明,rs12458-rs12825-rs867858之間存在緊密連鎖(D’為0.81～0.94)、rs904018-rs3203358之間也存在緊密連鎖(D’為0.95)。Haploview軟件分析顯示,rs867858、rs904018和rs884662位點為標(biāo)簽SNPs (Tag SNPs)。這3個標(biāo)簽SNPs(排列順序為rs867858、rs884662、rs904018)的單倍型分析顯示,ATC單倍型(OR=0.581,95%CI：0.567-0.986)和CCT單倍型(OR=3.698,95%CI:2.500-5.471)在CHDs組與對照組間的頻率具有統(tǒng)計學(xué)差異。其中,ATC單倍型為保護性單倍型,CCT單倍型是CHDs的風(fēng)險性單倍型。7.SNPs rs3203358影響miR-583對GATA4的表達調(diào)控通過構(gòu)建SNPs rs3203358C/G不同基因型GATA4-3' UTR表達載體,采用熒光素酶報告基因的方法研究發(fā)現(xiàn),miR-583可以顯著降低野生型C等位基因的熒光素酶活性,而對突變型G等位基因的熒光素酶活性沒有影響。該多態(tài)由CG的變化,逃逸了niR-583對GATA4的負調(diào)控,使基因相對高表達。結(jié)論1.通過microRNA表達譜芯片篩選及兩階段擴大樣本的qRT-PCR驗證,得到了5種血漿差異表達的microRNA(let-7e-5p、miR-155-5p、miR-222-3p、miR-433和miR-487b)可作為室間隔缺損診斷標(biāo)志物。構(gòu)建microRNA多指標(biāo)Logisit ic回歸分析模型,ROC曲線分析顯示,3種血漿microRNA(miR-let-7e、2miR-155-5p、 miR-222-3 P)聯(lián)合診斷模型的價值近似于5種nicroRNA的聯(lián)合,可顯著提高先心病的診斷效率,并具有臨床應(yīng)用的可行性。2.生物信息學(xué)分析預(yù)測得出差異表達microRNAs與先心病發(fā)生相關(guān)的靶基因,以及靶基因中可能參與調(diào)控的多條信號通路。microRNAs可能通過與多個靶基因的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)來影響心臟發(fā)育和先心病的形成。篩選出的3個核心基因(NOTCH1/GATA3/GATA4)靶序列的11個功能性SNPs可能會影響23種microRNA對靶基因的結(jié)合和表達調(diào)控,可作為深入研究的分子標(biāo)志物參考。3.GATA4基因6個microRNA靶位點多態(tài)性與CHDs有關(guān)聯(lián)。rs867858位點A/C、C/C基因型、C等位基因以及rs884662位點T/C、C/C基因型、C等位基因可能會增加CHDs發(fā)病風(fēng)險；rs904018位點/C、C/C基因型、C等位基因,rs12458位點A/T、T/T基因型、T等位基因,rs3203358位點C/G. G/G基因型、G等位基因,rs12825 G等位基因可能會降低CHDs發(fā)病風(fēng)險。3個標(biāo)簽SNPs綜合分析表明,ATC單倍型為保護性單倍型,CCT單倍型為風(fēng)險性單倍型。4.成功構(gòu)建和鑒定攜帶目的基因片段的pMIR-GATA4的重組質(zhì)粒,并通過熒光素酶報告基因?qū)嶒灣醪津炞C了GATA4基因3' UTR rs3203358 (1521 CG)可能是miR-583的靶位點,miR-583可能通過該多態(tài)位點的結(jié)合來調(diào)控GATA4基因的表達水平,進而影響先心病的易感性。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R725.4

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前3條

1 張程;鐘詩龍;張智偉;;先天性心臟病繼發(fā)性肺動脈高壓患者血漿中miRNA的研究[J];嶺南心血管病雜志;2014年04期

2 余章斌;韓樹萍;朱春;董小s

本文編號：2773731