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黃瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp.cucuifimViiiw)生物膜的形成及相關(guān)

發(fā)布時(shí)間:2017-02-26 09:30

  本文關(guān)鍵詞:黃瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp.cucuifimViiiw)生物膜的形成及相關(guān)基因功能分析,由筆耕文化傳播整理發(fā)布。


《廣西大學(xué)》 2015年

黃瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp.cucuifimViiiw)生物膜的形成及相關(guān)基因功能分析

李培謙  

【摘要】:黃瓜枯萎病(Cucumber Fusarium Wilt)是黃瓜生產(chǎn)上嚴(yán)重的土傳真菌病害。這種土傳真菌能夠在各種不同類型的土壤中存活并導(dǎo)致植株發(fā)病,病害一旦發(fā)生,往往會(huì)給黃瓜的質(zhì)量與產(chǎn)量造成嚴(yán)重的損失。黃瓜枯萎病菌是尖孢鐮刀菌黃瓜專化型(Fusarium oxysporum f. sp. cucumerinum)。關(guān)于尖孢鐮刀菌的致病機(jī)理方面已有很多報(bào)道,主要包括導(dǎo)管堵塞假說、毒素作用假說、細(xì)胞壁降解等。但是由于對病原菌生物學(xué)特性認(rèn)知的局限性,目前的研究還沒有完全闡明黃瓜枯萎病菌的致病機(jī)理,因此對黃瓜枯萎病的防治仍然沒有非常行之有效的措施。生物膜(biofilm)是微生物聚集在一起,附著在生物或者非生物的表面,并包埋在自身分泌的胞外物質(zhì)里,與浮游狀態(tài)相對的一種存在形式。生物膜的形成是人體、動(dòng)物病原菌致病的關(guān)鍵因素。受人體角膜炎病原菌(Fusarium oxysporum)能夠形成生物膜并參與致病的啟發(fā),本研究探索黃瓜枯萎病菌(F. oxysporum f. sp. cucumerinum)Foc-GD生物膜的形成與致病性的關(guān)系。主要開展生物膜形成條件的摸索、生物膜特性的分析、生物膜調(diào)控基因的挖掘及功能驗(yàn)證等方面的研究。主要取得以下結(jié)果:1、黃瓜枯萎病菌Foc-GD生物膜的形成方法及條件。研究發(fā)現(xiàn),用RPMI 1640培養(yǎng)基重懸黃瓜枯萎病菌Foc-GD孢子至106cfu/mL,將200μL標(biāo)準(zhǔn)的孢子懸浮液添加至平底96孔聚苯乙烯細(xì)胞培養(yǎng)板的每孔內(nèi),將細(xì)胞培養(yǎng)板置于28℃C培養(yǎng)箱內(nèi)靜置培養(yǎng)2h,用微量洗滌器將培養(yǎng)基及沒有黏附到培養(yǎng)板的孢子輕輕吸取,用PBS輕柔地漂洗兩次,最后粘附在細(xì)胞培養(yǎng)板表面的是生物膜的初始菌落,然后添加200μL RPMI 1640培養(yǎng)基于細(xì)胞培養(yǎng)板每個(gè)孔內(nèi)繼續(xù)靜置培養(yǎng)48h,至生物膜成熟。采用XTT(3,3'-[1-(苯氨酰基)-3,4-四氮唑]-二(4-甲氧基-6-硝基)苯磺酸鈉)減低法對生物膜進(jìn)行半定量測定。結(jié)果顯示,黃瓜枯萎病菌生物膜形成與培養(yǎng)基pH值、碳源和培養(yǎng)溫度有關(guān)。生物膜形成最適溫度是28℃,最適pH環(huán)境為微酸和中性環(huán)境(pH5-7),葡萄糖為碳源的培養(yǎng)基中能夠形成生物膜。2、病原菌Foc-GD生物膜特性分析。黃瓜枯萎病菌形成的生物膜用熒光染料染色后,借助激光共聚焦顯微鏡觀察生物膜微觀結(jié)構(gòu)。研究發(fā)現(xiàn)Foc-GD形成的成熟生物膜由濃密的菌絲細(xì)胞和胞外多糖分泌物組成,菌絲細(xì)胞與胞外多糖物質(zhì)緊密排列,形成質(zhì)地均一的復(fù)合體。成熟生物膜與浮游孢子相比,表現(xiàn)出對外界環(huán)境壓力不敏感型。研究發(fā)現(xiàn),在45℃的亞致死溫度下,處理30 min和min,成熟生物膜的代謝活動(dòng)無明顯影響,而浮游孢子代謝活動(dòng)分別降低了62.25%和86.29%。成熟生物膜與浮游孢子在-20℃,-10℃,4℃下處理24h,浮游孢子與成熟生物膜在4℃下代謝活動(dòng)沒有明顯差異,而-20℃,-10℃的低溫對成熟生物膜的影響明顯小于對浮游孢子的影響。樣品在紫外線下處理20min,30min后,成熟生物膜分別下降了29.18%、43.11%,而浮游孢子卻下降了52.29%、90.23%。用6.4μg/mL的多菌靈、咪酰胺、丙環(huán)唑分別處理樣品24h之后,成熟生物膜的代謝活動(dòng)分別下降了33.8%、39.2%和26.6%,而浮游孢子分別下降了76.5%、73.2%、50.7%。3、病原菌Foc-GD絲絨蛋白基因FocVell的克隆與表達(dá)。研究表明,絲絨蛋白FocVell(GenBank:KJ716229)編碼532個(gè)氨基酸,最大開放閱讀框?yàn)?596bp,含有1個(gè)94bp的內(nèi)含子。將FocVell氨基酸序列比對,分別與F.fujikuroi的FjVell (GenBank: FN548142), F. verticillioides的FvVel (GenBank:DQ274059), F. graminearum的FgVEA from (GenBank:JN635273)具有97.56%,97.74%,78.29%的相似性。借助實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析FocVell在野生型Foc-GD菌絲發(fā)育的24,36,48,60,72h表達(dá)情況。FocVell在菌絲發(fā)育的24和36h,表達(dá)量較低(p0.05);在48h,達(dá)到高峰,在60和72h,表達(dá)量相對降低并穩(wěn)定保持較高水平(p0.05)。FocVell的表達(dá)結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道黃瓜枯萎病菌分生孢子梗在48h之后增殖的結(jié)果是一致的。4、黃瓜枯萎病原菌絲絨蛋白基因FocVell的功能驗(yàn)證。利用基因敲除與回補(bǔ)的方法研究FocVell的功能。研究發(fā)現(xiàn),絲絨蛋白FocVell基因具有調(diào)控病原菌孢子發(fā)育、菌絲生長、細(xì)胞壁組分、生物膜形成與致病性的作用。用馬鈴薯葡萄糖(PDA)培養(yǎng)基培養(yǎng)菌株,FocVell敲除突變體△FocVell-3產(chǎn)孢量遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于野生型菌株Foc-GD和回補(bǔ)突變體△FocVell-3C(p 0.05),△FocVell-3菌落生長明顯變慢,氣生菌絲變少變短,并且菌絲分支明顯增多。分別用1.0 M KCl、1.0 M山梨醇、16 μg/mL異菌脲、0.2 μg/mL咪鮮胺、48μg/mL惡霉靈、0.05%剛果紅、5mM咖啡堿添加至培養(yǎng)基,研究菌落對滲透壓力與細(xì)胞破壞劑的敏感性。研究發(fā)現(xiàn),△Foc Vell-3對1.0 M KCl、1.0 M山梨醇、0.05%剛果紅、5 mM咖啡堿的敏感性下降(p0.05),對16 μg/mL異菌脲、0.2 μg/mL咪鮮胺的敏感性上升(p0.05),結(jié)果表明Focvell可能與細(xì)胞壁的組成、細(xì)胞壁的完整性有關(guān)。生物膜形成比較發(fā)現(xiàn),在聚苯乙烯片上,突變體△FocVell-3孢子在聚苯乙烯板上的聚集減少,而且孢子萌發(fā)和菌絲的生長延遲,△FocVell-3形成的生物膜比較稀薄,比較松散,菌絲與胞外物質(zhì)分布不均。XTT半定量法測定顯示野生型Foc-GD和回補(bǔ)型菌株△FocVell-3C成膜的量分別是基因敲除突變菌株△FocVell-3的1.23,1.52,1.69,2.56倍。用突變體△FocVell-3與野生型Foc-GD、回補(bǔ)型△FocVell-3C接種黃瓜苗,15天后,接種野生型Foc-GD和回補(bǔ)型△FocVell-3C的黃瓜苗逐漸發(fā)病并枯萎死亡,病情指數(shù)DSI分別為93.7和92.3,而接種FocVell基因敲除突變菌株△FocVell-3的黃瓜苗發(fā)病率明顯下降,多數(shù)黃瓜苗只出現(xiàn)輕微黃化癥狀,病情指數(shù)DSI為37.3(p0.05)。結(jié)果表明FocVell基因與黃瓜枯萎病菌F. oxysporum f. sp. cucumerinum生物膜形成及致病力有關(guān)。5、黃瓜枯萎病菌轉(zhuǎn)化GFP載體。借助激光共聚焦顯微鏡觀察到在接種病原菌孢子懸浮液24h后,孢子不斷萌發(fā)并粘附到黃瓜苗側(cè)根的表面,隨著接種時(shí)間的延長,病原菌逐漸刺穿側(cè)根表皮,進(jìn)入表皮細(xì)胞。侵染進(jìn)展期,病原菌侵入主根表皮,并不斷向維管束部分侵染,接種120h之后,即侵染后期,病原菌占據(jù)主根維管束部位,菌絲逐漸密集成交錯(cuò)菌絲網(wǎng)。本研究中黃瓜枯萎病菌Foc-GD FocVell基因敲除后,生物膜的形成受損,致病力下降,表明生物膜的形成是植物病原真菌重要的致病因子,該研究結(jié)果為揭示黃瓜枯萎病的致病機(jī)理提供新思路,對黃瓜枯萎病的綜合防控提供理論支持。

【關(guān)鍵詞】:
【學(xué)位授予單位】:廣西大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】:博士
【學(xué)位授予年份】:2015
【分類號(hào)】:S436.421.13
【目錄】:

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8 唐夢丹;鄭建鋒;趙敬軍;;曲霉生物膜研究進(jìn)展[A];2012全國中西醫(yī)結(jié)合皮膚性病學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2012年

9 李劍鋒;張紅東;邱楓;楊玉良;;離散變分原則在生物膜形變模擬中的應(yīng)用[A];2013年全國高分子學(xué)術(shù)論文報(bào)告會(huì)論文摘要集——主題B:高分子理論、計(jì)算與模擬[C];2013年

10 葉樹集;馬素蘭;李紅春;;生物膜上膽固醇傳輸動(dòng)力學(xué)的非線性光譜研究[A];中國化學(xué)會(huì)第十四屆膠體與界面化學(xué)會(huì)議論文摘要集-第1分會(huì):表面界面與納米結(jié)構(gòu)材料[C];2013年

中國重要報(bào)紙全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 記者 孫琪;[N];四川日報(bào);2011年

2 記者 盛利;[N];科技日報(bào);2011年

3 本報(bào)記者 常麗君;[N];科技日報(bào);2012年

4 常麗君;[N];科技日報(bào);2014年

5 實(shí)習(xí)生 操秀英;[N];科技日報(bào);2007年

6 田建軍;[N];經(jīng)濟(jì)參考報(bào);2004年

7 遼君;[N];衛(wèi)生與生活報(bào);2003年

8 本報(bào)記者 李穎;[N];中國花卉報(bào);2006年

9 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院;[N];中國漁業(yè)報(bào);2013年

10 唐偉;[N];科技日報(bào);2006年

中國博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 孫靜;表面附著、休眠對白色念珠菌生物膜滯留菌形成的影響及滯留菌相關(guān)基因的初步篩選[D];山東大學(xué);2015年

2 李培謙;黃瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp.cucuifimViiiw)生物膜的形成及相關(guān)基因功能分析[D];廣西大學(xué);2015年

3 陳穎;肺癌生物材料植入白色念珠菌—表皮葡萄球菌生物膜的形成與宿主免疫功能的關(guān)系[D];昆明醫(yī)科大學(xué);2015年

4 史惠卿;亞-MIC頭孢他啶、頭孢哌酮對大腸埃希菌生物膜形成的影響及機(jī)制研究[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2013年

5 王小燕;氣管導(dǎo)管材料表面細(xì)菌與真菌混合生物膜形成及真菌密度感應(yīng)分子對混合生物膜的作用研究[D];昆明醫(yī)科大學(xué);2015年

6 王培培;生防枯草芽胞桿菌NCD-2歯株豐產(chǎn)素合成和生物膜形成相關(guān)基因的功能分析[D];河北農(nóng)業(yè)大學(xué);2015年

7 梁伊麗;奧奈達(dá)希瓦氏菌氣液界面生物膜的生長及其機(jī)制研究[D];中南大學(xué);2009年

8 秦松巖;德國奧德河水中生物膜形態(tài)及其生物多樣性的研究[D];哈爾濱工業(yè)大學(xué);2008年

9 李雙陽;生物膜的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)關(guān)系的模擬研究[D];北京化工大學(xué);2010年

10 馬勇;模擬生物膜的電化學(xué)研究[D];華東師范大學(xué);2007年

中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 閆穎娟;基于生物膜形成的乳酸菌連續(xù)接種工藝研究[D];南京農(nóng)業(yè)大學(xué);2010年

2 王薇;管道特征對實(shí)際供水管網(wǎng)生物膜微生物種群多樣性的影響研究[D];浙江大學(xué);2015年

3 楊安逸;沼氣攪拌式固定床的工藝及其生物膜特性[D];黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué);2015年

4 王娟;抗生素鎖技術(shù)治療中心靜脈導(dǎo)管相關(guān)感染的實(shí)驗(yàn)室研究[D];長江大學(xué);2015年

5 尼逸倫;池塘生物膜低碳養(yǎng)殖新模式應(yīng)用研究[D];集美大學(xué);2015年

6 尹正國;脫管散體外抗銅綠假單胞菌生物膜作用的研究[D];甘肅中醫(yī)藥大學(xué)(原名:甘肅中醫(yī)學(xué)院);2015年

7 董麗紅;棉花根系分泌物對枯草芽胞桿菌NCD-2菌株生物膜形成的影響[D];河北農(nóng)業(yè)大學(xué);2015年

8 謝冰涵;低溫對MFC產(chǎn)電性能及陽極生物膜群落結(jié)構(gòu)影響的研究[D];哈爾濱工業(yè)大學(xué);2015年

9 翟振;LEA蛋白特征重復(fù)片段對POPE生物膜的干燥保護(hù)活性研究[D];上海理工大學(xué);2015年

10 劉慧娜;給水管網(wǎng)管壁生物膜微生物多樣性研究[D];天津大學(xué);2007年


  本文關(guān)鍵詞:黃瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp.cucuifimViiiw)生物膜的形成及相關(guān)基因功能分析,由筆耕文化傳播整理發(fā)布。



本文編號(hào):245672

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