L-阿拉伯糖異構(gòu)酶(L-Arabinose Isomerase,L-AI)是生物法異構(gòu)化D-半乳糖為D-塔格糖的關(guān)鍵酶。本研究從腌菜和泡菜中分離出一批乳酸菌,經(jīng)紙色譜法初篩和改良半胱氨酸咔唑法復(fù)篩,獲得1株粗酶酶活達(dá)13.95U/m L的高產(chǎn)D-塔格糖的乳酸菌,通過(guò)NCBI進(jìn)行16S rDNA序列比對(duì)及生化特征分析,鑒定其為植物乳桿菌并命名為WU14。上傳這株菌株部分16S rDNA基因序列至NCBI基因庫(kù),獲得Genbank序列登入號(hào):KJ918744。根據(jù)菌種特異性及基因保守性設(shè)計(jì)L-阿拉伯糖異構(gòu)酶基因引物,通過(guò)PCR擴(kuò)增得到這株菌株的L-阿拉伯糖異構(gòu)酶基因,對(duì)這株菌株的L-阿拉伯糖異構(gòu)酶基因進(jìn)行TA克隆并上傳該段基因序列至Genbank。此外,通過(guò)對(duì)Lactobacillus plantarum WU14的L-阿拉伯糖異構(gòu)酶基因進(jìn)行生物信息學(xué)研究及其粗酶酶學(xué)性質(zhì)的研究來(lái)深入了解植物乳桿菌的L-阿拉伯糖異構(gòu)酶蛋白結(jié)構(gòu)及其特異性。結(jié)果顯示:Lactobacillus plantarum WU14 L-阿拉伯糖異構(gòu)酶的構(gòu)成是以α-螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲為主且不具有信號(hào)肽也不具有跨膜結(jié)構(gòu)的一類胞內(nèi)酶。該酶在最佳溫度60℃,最佳pH7.17,最適底物濃度為0.8mol/L反應(yīng)28h時(shí),其轉(zhuǎn)化率達(dá)到56.12%。L.plantarum WU14的L-AI基因獲得Genbank序列登入號(hào):KJ778785。以不改變L-AI的氨基酸一級(jí)結(jié)構(gòu)為前提,通過(guò)設(shè)計(jì)L.plantarum WU14的L-AI基因的特異性內(nèi)外引物,運(yùn)用重組PCR技術(shù)去除L-AI基因中的NcoⅠ酶切位點(diǎn),再將重組L-AI基因插入含有NcoⅠ和HindⅢ酶切位點(diǎn)的食品級(jí)表達(dá)載體pRNA48中得到重組質(zhì)粒并電轉(zhuǎn)入Lactococcus lactis NZ9000感受態(tài)細(xì)胞中,獲得了L.lactis NZ9000/pRNA48-L-AI。利用nisin對(duì)L.lactis NZ9000/pRNA48-L-AI進(jìn)行誘導(dǎo),提取胞內(nèi)蛋白后后采用聚丙烯酰胺凝膠電泳(sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)和改良的半胱氨酸咔唑法分析目的蛋白的表達(dá)情況及粗酶酶活。結(jié)果顯示:當(dāng)菌液中nisin誘導(dǎo)濃度達(dá)到30ng/m L,誘導(dǎo)12h后,目的蛋白表達(dá)量達(dá)到最大,60℃下,粗酶酶活達(dá)到6.21U/mL。與此同時(shí),以重懸的菌液和超聲波破碎得到的粗酶液進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn),在溫度為50℃,pH7.17左右,D-半乳糖濃度為0.6 mol/L時(shí),L.lactis NZ9000/pRNA48-L-AI轉(zhuǎn)化D-半乳糖為D-塔格糖的能力最佳,轉(zhuǎn)化率達(dá)到38.31%。
【學(xué)位單位】：江西農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2015
【中圖分類】：Q936
【文章目錄】：
摘要
Abstract
英文縮略表
第一章 緒論
    1.1 植物乳桿菌的生理功能及其應(yīng)用
    1.2 D-塔格糖研究進(jìn)展
        1.2.1 D塔格糖的理化性質(zhì)與作用
        1.2.2 D-塔格糖的代謝
        1.2.3 D-塔格糖的制取方法
        1.2.4 L-AI酶法制備D-塔格糖
    1.3 乳酸乳球菌食品級(jí)誘導(dǎo)表達(dá)載體pRNA48
    1.4 重組PCR技術(shù)
        1.4.1 重組PCR三大分支
        1.4.2 重組PCR的應(yīng)用
        1.4.3 重組PCR技術(shù)要點(diǎn)
    1.5 課題來(lái)源、研究目的與意義
        1.5.1 本論文課題來(lái)源
        1.5.2 研究目的與意義
第二章 高產(chǎn)D-塔格糖乳酸菌的篩選與鑒定
    2.1 實(shí)驗(yàn)材料
        2.1.1 菌種
        2.1.2 儀器設(shè)備
        2.1.3 主要生化試劑
        2.1.4 所用引物
        2.1.5 培養(yǎng)基及主要試劑的配制
    2.2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.2.1 菌株的富集培養(yǎng)與分離
        2.2.2 高產(chǎn)D-塔格糖菌株的初篩
        2.2.3 高產(chǎn)D-塔格糖菌株的復(fù)篩與L-AI粗酶酶活測(cè)定
        2.2.4 菌株初步鑒定
        2.2.5 改良CTAB法提取待測(cè)菌株全基因組
        2.2.6 16S rDNA的擴(kuò)增
        2.2.7 16S rDNA測(cè)序及構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)
    2.3 結(jié)果與分析
        2.3.1 高產(chǎn)D-塔格糖乳酸菌的初篩結(jié)果
        2.3.2 高產(chǎn)D-塔格糖乳酸菌的復(fù)篩
        2.3.3 高產(chǎn)D-塔格糖乳酸菌菌種鑒定
    2.4 本章小結(jié)
第三章 L-AI基因的擴(kuò)增、克隆及生物信息學(xué)分析
    3.1 實(shí)驗(yàn)材料
        3.1.1 菌種
        3.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器
        3.1.3 主要生化試劑
        3.1.4 所用引物
        3.1.5 培養(yǎng)基及主要試劑的配制
    3.2 實(shí)驗(yàn)方法
        3.2.1 菌種活化
        3.2.2 E. coli DH5α 感受態(tài)細(xì)胞的制備
        3.2.3 L-AI基因的擴(kuò)增
        3.2.4 PCR產(chǎn)物的純化
        3.2.5 L-AI基因的TA克隆與菌落PCR鑒定陽(yáng)性菌
        3.2.6 質(zhì)粒PCR鑒定陽(yáng)性菌
        3.2.7 L.plantarum WU14 L-AI基因的生物信息學(xué)研究
    3.3 結(jié)果與分析
        3.3.1 L-AI基因的擴(kuò)增與比對(duì)
        3.3.2 L-AI基因的TA克隆
        3.3.3 高產(chǎn)D-塔格糖乳酸菌L-AI基因的核苷酸序列分析
        3.3.4 高產(chǎn)D-塔格糖乳酸菌L-AI蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析
        3.3.5 高產(chǎn)D-塔格糖乳酸菌L-AI蛋白跨膜螺旋分析和信號(hào)肽分析
        3.3.6 高產(chǎn)D-塔格糖乳酸菌L-AI蛋白的疏水性分析
        3.3.7 高產(chǎn)D-塔格糖乳酸菌L-AI蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析
    3.4 本章小結(jié)
第四章 L. plantarum WU14的L-AI酶學(xué)性質(zhì)的研究
    4.1 實(shí)驗(yàn)材料
        4.1.1 實(shí)驗(yàn)菌株
        4.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器
        4.1.3 培養(yǎng)基及主要試劑的配制
    4.2 試驗(yàn)方法
        4.2.1 菌種活化、發(fā)酵培養(yǎng)和酶反應(yīng)液的制備
        4.2.2 L. plantarum WU14的L-AI最佳轉(zhuǎn)化溫度的測(cè)定
        4.2.3 L. plantarum WU14的L-AI最佳轉(zhuǎn)化pH的測(cè)定
        4.2.4 L. plantarum WU14的L-AI最佳底物濃度的測(cè)定
        4.2.5 各種金屬離子對(duì)L. plantarum WU14的L-AI轉(zhuǎn)化反應(yīng)的影響
    4.3 結(jié)果與分析
        4.3.1 L. plantarum WU14的L-AI最佳轉(zhuǎn)化溫度
        4.3.2 L. plantarum WU14的L-AI最佳轉(zhuǎn)化pH
        4.3.3 L. plantarum WU14的L-AI最佳底物濃度
        4.3.4 各種金屬離子對(duì)L. plantarum WU14的L-AI轉(zhuǎn)化反應(yīng)的影響
    4.4 本章小結(jié)
第五章 L. plantarum WU14的L-AI在L . lactis NZ9000中的食品級(jí)誘導(dǎo)表達(dá)
    5.1 實(shí)驗(yàn)材料
        5.1.1 試驗(yàn)菌株及質(zhì)粒
        5.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器
        5.1.3 主要生化試劑
        5.1.4 所用引物
        5.1.5 培養(yǎng)基及主要試劑的配制
    5.2 實(shí)驗(yàn)方法
        5.2.1 重組PCR技術(shù)去除L-AI基因中NCOⅠ酶切位點(diǎn)
        5.2.2 重組質(zhì)粒pRNA48-L-AI的構(gòu)建
        5.2.3 連接產(chǎn)物電轉(zhuǎn)化和克隆子篩選
        5.2.4 目的基因L-AI的誘導(dǎo)表達(dá)及SDS-PAGE鑒定
    5.3 結(jié)果與分析
        5.3.1 L..plantarum WU14L-AI基因NCOⅠ及HindⅢ酶切位點(diǎn)的判定
        5.3.2 重組PCR技術(shù)去除L..plantarum WU14的L-AI基因中的NCOⅠ酶切位點(diǎn)
        5.3.3 重組質(zhì)粒pRNA48-L-AI的構(gòu)建及驗(yàn)證
        5.3.4 SDS-PAGE鑒定目的基因的誘導(dǎo)表達(dá)
    5.4 本章小結(jié)
第六章 重組菌L. lactis NZ9000/pRNA48-L-AI的L-AI遺傳穩(wěn)定性分析及酶學(xué)性質(zhì)研究
    6.1 實(shí)驗(yàn)材料
        6.1.1 試驗(yàn)菌株
        6.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器
        6.1.3 培養(yǎng)基及主要試劑的配制
    6.2 試驗(yàn)方法
        6.2.1 nisin誘導(dǎo)異源L-AI基因表達(dá)的最佳誘導(dǎo)劑量及誘導(dǎo)時(shí)間
        6.2.2 L. lactis NZ9000/ pRNA48-L-AI重組菌的遺傳穩(wěn)定性分析
        6.2.3 L. lactis NZ9000/ pRNA48-L-AI重組菌L-阿拉伯糖異構(gòu)酶酶學(xué)性質(zhì)的研究
    6.3 結(jié)果與分析
        6.3.1 nisin誘導(dǎo)L-AI基因表達(dá)的最佳誘導(dǎo)劑量及誘導(dǎo)時(shí)間
        6.3.2 L. lactis NZ9000/ pRNA48-L-AI重組菌的遺傳穩(wěn)定性分析
        6.3.3 L. lactis NZ9000/ pRNA48-L-AI重組菌L-阿拉伯糖異構(gòu)酶學(xué)性質(zhì)的研究
    6.4 本章小結(jié)
第七章 全文結(jié)論
參考文獻(xiàn)
致謝
作者簡(jiǎn)歷

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本文編號(hào)：2890480