奶牛乳房炎主要是由病原微生物侵入奶牛乳腺組織引起的炎癥。該病發(fā)病率高、治愈難度大,導致牛奶產(chǎn)量減少、品質(zhì)下降,是最終引發(fā)臨床型乳房炎而導致奶牛淘汰、死亡的重要疫病之一。已報道引起奶牛乳房炎病原微生物主要為金黃色葡萄球菌、鏈球菌和大腸桿菌,由這三種病原引起的奶牛乳房炎約占該病發(fā)病總數(shù)的90%以上。目前,由大腸桿菌所引起的奶牛乳房炎逐漸增加,特別在發(fā)達國家,大腸桿菌性奶牛乳房炎發(fā)病率已達到28.39%。我國由大腸桿菌引起的乳房炎的比例較高,如佛山地區(qū)大腸桿菌引起的奶牛乳房炎達50%,蘭州地區(qū)大腸桿菌引起的奶牛乳房炎占24.44%,河南是養(yǎng)殖大省,奶牛的存欄量近幾年急劇增加,而奶牛乳房炎的發(fā)生率也居高不下,導致奶牛的淘汰率上升,牛奶品質(zhì)下降,嚴重影響著奶牛業(yè)的發(fā)展。許多研究表明,細菌之間、細菌與宿主之間、細菌與環(huán)境之間具有密切聯(lián)系。而密度感應(quorum sensing,QS)就是細菌中普遍存在的一種調(diào)控系統(tǒng),該系統(tǒng)在同種細菌之間、異種細菌之間、細菌胞內(nèi)及胞外的信息交流中發(fā)揮著十分重要的作用。LuxS/AI-2型密度感應系統(tǒng)均存在于革蘭陰性菌和革蘭陽性菌,可通過細菌產(chǎn)生的信號分子(Auto-inducer,AI)來協(xié)調(diào)細菌群體功能及調(diào)控細菌的質(zhì)粒轉(zhuǎn)移、生物被膜(biofilm)的形成、毒力基因的表達和細菌發(fā)光等。目前,研究細菌之間的信息交流已成為獸醫(yī)微生物學研究的新熱點。大腸桿菌耐藥性尤其是多重耐藥的出現(xiàn)迫切需要采用新的方式來進行大腸桿菌引起的奶牛乳房炎病的防控。干擾或者阻斷大腸桿菌的細菌密度感應系統(tǒng),尤其是抑制LuxS/AI-2型密度感應系統(tǒng),可以成為防控大腸桿菌導致的乳房炎的新途徑。目前,對奶牛乳房炎大腸桿菌的AI-2信號分子對細菌的致病機制研究不多,本研究率先報道在奶牛乳房炎大腸桿菌中存在LuxS/AI-2型密度感應系統(tǒng),通過以下兩個方面對該系統(tǒng)進行了相關(guān)研究,以期為后續(xù)AI-2體外合成、AI-2對大腸桿菌的粘附性、毒力因子調(diào)控及研究抑制AI-2信號分子產(chǎn)生的新型藥物等奠定堅實的基礎。1.奶牛乳房炎大腸桿菌AI-2信號分子檢測為了了解奶牛乳房炎大腸桿菌不同分離株產(chǎn)生AI-2(Autoinducer-2,AI-2)信號情況,探索不同的生長時期、不同培養(yǎng)條件對大腸桿菌AI-2產(chǎn)生的影響,檢測信號分子AI-2的合成與lux S基因及pfs基因的轉(zhuǎn)錄水平間的相互關(guān)系。本實驗以哈維弧菌BB170(vibrio harveyi BB170)為發(fā)光菌株,對來自奶牛乳房炎大腸桿菌的不同分離株E285、E80814、W41、E30707和EA701205菌株進行AI-2信號分子的檢測,在此基礎上以E285為檢測菌株,分析大腸桿菌E285在不同生長時期與不同培養(yǎng)條件下AI-2活性情況,同時應用實時熒光定量PCR檢測大腸桿菌E285在不同生長時期和不同培養(yǎng)條件下AI-2信號分子產(chǎn)生的與lux S基因與pfs基因轉(zhuǎn)錄水平的相關(guān)性。試驗結(jié)果表明,奶牛乳房炎大腸桿菌不同分離株E285、E80814、W41、E30707和EA701205株均有AI-2信號分子產(chǎn)生,但產(chǎn)生的AI-2的量均低于陽性對照;對不同生長時期的AI-2活性檢測結(jié)果表明,在遲緩期、對數(shù)前期E285的基本沒有AI-2的表達,從對數(shù)中期開始大腸桿菌E285中的AI-2開始大量表達,到對數(shù)后期達到高峰,為陰性對照的12倍,隨后下降,到穩(wěn)定期已下降為陰性對照的3.6倍。不同培養(yǎng)條件分析結(jié)果顯示,培養(yǎng)基中加入蔗糖、麥芽糖、葡萄糖、甘露醇、Na Cl及乳糖時,AI-2的活性與lux S基因轉(zhuǎn)錄水平均明顯提高,兩者具有一致性,其中加入乳糖后E285株的AI-2上調(diào)倍數(shù)最大。而AI-2的活性與pfs基因的轉(zhuǎn)錄水平?jīng)]有明顯的相關(guān)性。由此證明,奶牛乳房炎大腸桿菌分離株均能產(chǎn)生AI-2信號分子,其AI-2信號分子的產(chǎn)生與lux S基因轉(zhuǎn)錄水平具有高度的相關(guān)性,與pfs基因的轉(zhuǎn)錄水平無明顯相關(guān)性;蔗糖、麥芽糖、葡萄糖、甘露醇、Na Cl及乳糖能夠促進大腸桿菌E285產(chǎn)生AI-2信號分子。通過對LuxS/AI-2型密度感應系統(tǒng)的研究,為進一步研究該系統(tǒng)在奶牛乳房炎大腸桿菌中的作用打下堅實的基拙。2.lux S和pfs基因克隆、表達及純化在細菌LuxS/AI-2型密度感應系統(tǒng)中,LuxS蛋白和Pfs蛋白是催化AI-2信號分子產(chǎn)生過程中的兩個關(guān)鍵酶。為了了解編碼LuxS蛋白和Pfs蛋白的基因變異情況,獲得重組LuxS和Pfs蛋白,本試驗根據(jù)Genbank中l(wèi)ux S(YP-001199965)和pfs(NC-009443)公布的基因序列,針對lux S基因和pfs基因序列分別設計一對特異性引物,以大腸桿菌E285的DNA為模板,應用PCR擴增獲得了lux S基因和pfs基因片段,純化后分別用Eco RI和Hind III雙酶切后插入原核表達載體p ET30a中,經(jīng)PCR和酶切鑒定后進行序列測定及分析,將獲得的重組質(zhì)粒p ET30a-lux S和p ET30a-pfs轉(zhuǎn)化BL21,經(jīng)IPTG誘導,獲得可溶性重組LuxS和Pfs蛋白,經(jīng)His標簽蛋白純化試劑盒純化后分別免疫新西蘭大白兔,制備的高免血清,利用western-blotting檢測重組蛋白的免疫原性。試驗結(jié)果表明,擴增獲得的lux S基因和pfs基因高度保守,與Genbank中已發(fā)表的核苷酸序列同源性均達到98%以上,說明lux S基因和pfs基因奶牛乳房炎大腸桿菌中普遍存在,為高度保守的基因;且兩基因在原核表達系統(tǒng)中能夠高效表達可溶性重組蛋白,上清經(jīng)純化獲得的重組LuxS蛋白和Pfs蛋白濃度分別為4.6mg/m L和5.3mg/m L;western blotting檢測結(jié)果顯示重組蛋白LuxS和Pfs具有良好的免疫原性。通過對lux S和pfs基因克隆、表達,為AI-2信號分子的體外合成提供技術(shù)支持。
【學位單位】：河南農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2017
【中圖分類】：S852.61
【部分圖文】：

菌就會在 AI-2 的介導下具有與 luxS 缺陷型的 Porphyromonas gingivalis 形成混合生能[108]。這些證據(jù)都表明，AI-2 的生成有利于細菌和細菌以及不同菌株之間的聯(lián)系圖 1 哈氏弧菌的群體感應系統(tǒng)Fig.1 Vibrio quorum sensing system

圖 1-1 不同的奶牛乳房炎大腸桿菌 AI-2 的檢測Fig.1-1 Detection of different bovine pathogenic E.coli AI-2

圖 1-2 E285 株在不同生長時期 AI-2 活性檢測Fig.1-2 Detection ofAI-2 Activity in E285 Strains at different growth stages3.3 檢測不同培養(yǎng)條件下 E285 株 AI-2 活性將大腸桿菌 E285 株分別接種于含 0.5%的蔗糖、0.5%的麥芽糖、0.5%的葡萄甘露醇、0.5%的 NaCl 及 0.5%的乳糖 LB 液體培養(yǎng)基中，同時將大腸桿菌 E285 株
【參考文獻】

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本文編號：2887636