丁香假單胞菌是一種常見植物致病菌,可以引發(fā)多種植物產生超敏反應,而且該菌還是一種冰核細菌,可使植物在較高溫度下產生凍害。誘發(fā)植物凍害的關鍵因素為其分泌的一種蛋白,冰核蛋白(Ice nucleation protein, INP)。本課題以一株具有高冰核活性的丁香假單胞菌MB03為研究對象,構建了一個轉座突變文庫,對影響丁香假單胞菌冰核蛋白分泌的相關活性效應基因的進行了研究。 丁香假單胞菌MB03是本實驗室所分離保存的一株具有高冰核活性的丁香假單胞菌,其INP基因inaQ已完成克隆測序。本實驗利用“自殺性”轉座子pUT-mini Tn5-Km2,采用雙親本接合的方法構建了丁香假單胞菌MB03的突變文庫。根據inaQ基因序列設計引物擴增得到其N端,連接pET-28a表達載體,獲得INPN蛋白并制備其抗血清,然后利用免疫學方法對INP分泌進行分析。先用膜雜交的方法對突變文庫中菌株進行初步篩選,從中篩選出INP分泌發(fā)生明顯變化的菌株,再對這些菌株進行Cy5流式細胞儀檢測驗證,從而得到INP分泌明顯增強和明顯減弱的菌株。 對突變菌株的轉座子插入位點鑒定采用改進的TAIL-PCR方法,通過已...

【文章頁數】：63 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
縮略語表
1. 前言
    1.1 冰核蛋白研究背景
        1.1.1 冰核細菌與冰核蛋白簡介
        1.1.2 冰核蛋白結構與功能
        1.1.3 冰晶核蛋白的應用
    1.2 轉座子Tn5背景
        1.2.1 轉座的概念
        1.2.2 轉座的分類
        1.2.3 轉座的遺傳學效應
        1.2.4 Tn5轉座子的介紹
        1.2.5 pUT mini-Tn5 Km2轉座子
        1.2.6 轉座子的應用
    1.3 轉座子插入位點鑒定方法
        1.3.1 質粒拯救法
        1.3.2 反向PCR法
        1.3.3 接頭法
        1.3.4 TAIL-PCR法
        1.3.5 改進的TAIL-PCR法
    1.4 檸檬酸合成酶
        1.4.1 三羧酸循環(huán)
        1.4.2 檸檬酸合成酶
    1.5 研究目的與意義
2. 材料與方法
    2.1 實驗材料
        2.1.1 所用菌株與質粒
        2.1.2 培養(yǎng)基
        2.1.3 實驗所需試劑
        2.1.4 實驗所用儀器
    2.2 實驗方法
        2.2.1 大腸桿菌質粒抽提
        2.2.2 大腸桿菌感受態(tài)細胞制備
        2.2.3 丁香假單胞菌總DNA提取
        2.2.4 DNA體外重組與克隆構建
        2.2.5 突變文庫構建
        2.2.6 丁香假單胞菌INP分泌誘導
        2.2.7 SDS-PAGE電泳
        2.2.8 Western Blot實驗
        2.2.9 膜雜交實驗
        2.2.10 流式細胞儀分析
        2.2.11 總RNA的提取
        2.2.12 RNA純化及檢測
        2.2.13 RNA的反轉錄
        2.2.14 Real Time PCR
        2.2.15 實驗流程示意圖
3. 結果與分析
    3.1 轉座子mini-Tn5轉座突變文庫的構建與冰核蛋白InaQ分泌活性增強或減弱突變株篩選
        3.1.1 丁香假單胞菌MB03菌株的mini-Tn5突變文庫的構建
        3.1.2 從MB03突變文庫中篩選效應菌株
    3.2 突變株中轉座子插入位點的鑒定
        3.2.1 反向PCR
        3.2.2 半隨機的TAIL-PCR
        3.2.3 插入位點序列的BLAST分析
    3.3 檸檬酸合成酶與INP分泌關系研究
        3.3.1 表達補償載體和補償菌株的構建
        3.3.2 INP表達的變化
4. 小結
5. 討論
    5.1 轉座突變文庫的意義
    5.2 冰核蛋白的分泌機制研究
    5.3 對插入位點的研究
    5.4 檸檬酸合酶的作用
    5.5 展望
參考文獻
致謝



本文編號：4040377