丁香假單胞菌是一種常見(jiàn)植物致病菌,可以引發(fā)多種植物產(chǎn)生超敏反應(yīng),而且該菌還是一種冰核細(xì)菌,可使植物在較高溫度下產(chǎn)生凍害。誘發(fā)植物凍害的關(guān)鍵因素為其分泌的一種蛋白,冰核蛋白(Ice nucleation protein, INP)。本課題以一株具有高冰核活性的丁香假單胞菌MB03為研究對(duì)象,構(gòu)建了一個(gè)轉(zhuǎn)座突變文庫(kù),對(duì)影響丁香假單胞菌冰核蛋白分泌的相關(guān)活性效應(yīng)基因的進(jìn)行了研究。 丁香假單胞菌MB03是本實(shí)驗(yàn)室所分離保存的一株具有高冰核活性的丁香假單胞菌,其INP基因inaQ已完成克隆測(cè)序。本實(shí)驗(yàn)利用“自殺性”轉(zhuǎn)座子pUT-mini Tn5-Km2,采用雙親本接合的方法構(gòu)建了丁香假單胞菌MB03的突變文庫(kù)。根據(jù)inaQ基因序列設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增得到其N端,連接pET-28a表達(dá)載體,獲得INPN蛋白并制備其抗血清,然后利用免疫學(xué)方法對(duì)INP分泌進(jìn)行分析。先用膜雜交的方法對(duì)突變文庫(kù)中菌株進(jìn)行初步篩選,從中篩選出INP分泌發(fā)生明顯變化的菌株,再對(duì)這些菌株進(jìn)行Cy5流式細(xì)胞儀檢測(cè)驗(yàn)證,從而得到INP分泌明顯增強(qiáng)和明顯減弱的菌株。 對(duì)突變菌株的轉(zhuǎn)座子插入位點(diǎn)鑒定采用改進(jìn)的TAIL-PCR方法,通過(guò)已...

【文章頁(yè)數(shù)】：63 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
縮略語(yǔ)表
1. 前言
    1.1 冰核蛋白研究背景
        1.1.1 冰核細(xì)菌與冰核蛋白簡(jiǎn)介
        1.1.2 冰核蛋白結(jié)構(gòu)與功能
        1.1.3 冰晶核蛋白的應(yīng)用
    1.2 轉(zhuǎn)座子Tn5背景
        1.2.1 轉(zhuǎn)座的概念
        1.2.2 轉(zhuǎn)座的分類
        1.2.3 轉(zhuǎn)座的遺傳學(xué)效應(yīng)
        1.2.4 Tn5轉(zhuǎn)座子的介紹
        1.2.5 pUT mini-Tn5 Km2轉(zhuǎn)座子
        1.2.6 轉(zhuǎn)座子的應(yīng)用
    1.3 轉(zhuǎn)座子插入位點(diǎn)鑒定方法
        1.3.1 質(zhì)粒拯救法
        1.3.2 反向PCR法
        1.3.3 接頭法
        1.3.4 TAIL-PCR法
        1.3.5 改進(jìn)的TAIL-PCR法
    1.4 檸檬酸合成酶
        1.4.1 三羧酸循環(huán)
        1.4.2 檸檬酸合成酶
    1.5 研究目的與意義
2. 材料與方法
    2.1 實(shí)驗(yàn)材料
        2.1.1 所用菌株與質(zhì)粒
        2.1.2 培養(yǎng)基
        2.1.3 實(shí)驗(yàn)所需試劑
        2.1.4 實(shí)驗(yàn)所用儀器
    2.2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.2.1 大腸桿菌質(zhì)粒抽提
        2.2.2 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞制備
        2.2.3 丁香假單胞菌總DNA提取
        2.2.4 DNA體外重組與克隆構(gòu)建
        2.2.5 突變文庫(kù)構(gòu)建
        2.2.6 丁香假單胞菌INP分泌誘導(dǎo)
        2.2.7 SDS-PAGE電泳
        2.2.8 Western Blot實(shí)驗(yàn)
        2.2.9 膜雜交實(shí)驗(yàn)
        2.2.10 流式細(xì)胞儀分析
        2.2.11 總RNA的提取
        2.2.12 RNA純化及檢測(cè)
        2.2.13 RNA的反轉(zhuǎn)錄
        2.2.14 Real Time PCR
        2.2.15 實(shí)驗(yàn)流程示意圖
3. 結(jié)果與分析
    3.1 轉(zhuǎn)座子mini-Tn5轉(zhuǎn)座突變文庫(kù)的構(gòu)建與冰核蛋白InaQ分泌活性增強(qiáng)或減弱突變株篩選
        3.1.1 丁香假單胞菌MB03菌株的mini-Tn5突變文庫(kù)的構(gòu)建
        3.1.2 從MB03突變文庫(kù)中篩選效應(yīng)菌株
    3.2 突變株中轉(zhuǎn)座子插入位點(diǎn)的鑒定
        3.2.1 反向PCR
        3.2.2 半隨機(jī)的TAIL-PCR
        3.2.3 插入位點(diǎn)序列的BLAST分析
    3.3 檸檬酸合成酶與INP分泌關(guān)系研究
        3.3.1 表達(dá)補(bǔ)償載體和補(bǔ)償菌株的構(gòu)建
        3.3.2 INP表達(dá)的變化
4. 小結(jié)
5. 討論
    5.1 轉(zhuǎn)座突變文庫(kù)的意義
    5.2 冰核蛋白的分泌機(jī)制研究
    5.3 對(duì)插入位點(diǎn)的研究
    5.4 檸檬酸合酶的作用
    5.5 展望
參考文獻(xiàn)
致謝



本文編號(hào)：4040377