發(fā)布時間：2025-04-18 02:14

　　細(xì)胞凋亡(apoptosis)是指在多細(xì)胞生物體中由多種因子介導(dǎo)的細(xì)胞主動死亡的過程。自從上世紀(jì)90年代初開始,在哺乳動物、線蟲和果蠅中細(xì)胞凋亡的研究已經(jīng)非常廣泛并且深入,其凋亡的分子機(jī)制也取得了很大進(jìn)展。目前關(guān)于細(xì)胞凋亡的途徑主要有兩種,其中線粒體凋亡通路是其主要的途徑。雖然細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制在進(jìn)化過程之中高度保守,但研究發(fā)現(xiàn)在線粒體介導(dǎo)的內(nèi)源性凋亡途徑中,哺乳動物是通過線粒體釋放細(xì)胞色素C到胞質(zhì)中引起細(xì)胞凋亡,而在果蠅和線蟲的細(xì)胞凋亡中卻與此不同。但是在鱗翅目昆蟲細(xì)胞凋亡的研究中卻發(fā)現(xiàn)細(xì)胞色素C的作用與哺乳動物相似,凋亡過程有細(xì)胞色素C釋放事件。鑒于迄今為止關(guān)于鱗翅目昆蟲細(xì)胞凋亡過程中細(xì)胞色素C釋放的檢測、定位或者無細(xì)胞體系研究均是以哺乳動物細(xì)胞色素C和抗體進(jìn)行的,為了闡明細(xì)胞色素C在鱗翅目昆蟲細(xì)胞凋亡過程中的作用及分子機(jī)制,我們將斜紋夜蛾細(xì)胞色素C的原核表達(dá)重組質(zhì)粒(pET-28a-Cyt C)進(jìn)行蛋白誘導(dǎo)表達(dá)純化,將純化出的內(nèi)源性Cyt C蛋白用于斜紋夜蛾無細(xì)胞凋亡體系的研究；同時構(gòu)建斜紋夜蛾Cyt C的真核表達(dá)載體,將其轉(zhuǎn)染SL-1細(xì)胞,最終運(yùn)用形態(tài)學(xué)觀察,熒光定量法及細(xì)胞流式...

【文章頁數(shù)】：50 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
1. 前言
    1.1 細(xì)胞凋亡概述
        1.1.1 細(xì)胞凋亡概念
        1.1.2 細(xì)胞凋亡的特征描述
        1.1.3 細(xì)胞凋亡與細(xì)胞壞死的區(qū)別
    1.2 細(xì)胞凋亡的途徑
        1.2.1 外源性細(xì)胞的凋亡通路
        1.2.2 內(nèi)源性的細(xì)胞凋亡通路
    1.3 細(xì)胞色素C在細(xì)胞凋亡中的作用
        1.3.1 細(xì)胞色素C的釋放在凋亡級聯(lián)反應(yīng)中必不可少
        1.3.2 細(xì)胞色素C磷酸化作用可以調(diào)控細(xì)胞色素C的釋放以及凋亡體的形成
        1.3.3 細(xì)胞色素C經(jīng)過心磷脂氧化作用有助于自身的釋放
    1.4 無細(xì)胞體系(cell-free system)與細(xì)胞凋亡
        1.4.1 無細(xì)胞體系
        1.4.2 無細(xì)胞體系與細(xì)胞凋亡的關(guān)系
        1.4.3 無細(xì)胞體系的分類及制備方法
    1.5 半胱氨酸蛋白酶(caspase)與細(xì)胞凋亡
        1.5.1 半胱氨酸蛋白酶概述
        1.5.2 Caspase與細(xì)胞凋亡
    1.6 研究背景和意義
2. 實(shí)驗(yàn)材料和方法
    2.1 實(shí)驗(yàn)材料
        2.1.1 昆蟲細(xì)胞
        2.1.2 菌種和載體
        2.1.3 主要試劑與試劑盒
        2.1.4 實(shí)驗(yàn)試劑的配制
        2.1.5 實(shí)驗(yàn)主要儀器設(shè)備
    2.2 實(shí)驗(yàn)方法與操作步驟
        2.2.1 昆蟲細(xì)胞的復(fù)蘇與培養(yǎng)
        2.2.2 SL-1 CytC蛋白的純化(以活化50mL為例)
        2.2.3 蛋白免疫印跡檢測純化蛋白
        2.2.4 SL-1 CytC多克隆抗體的制備
        2.2.5 SL-1細(xì)胞無細(xì)胞體系的制備
        2.2.6 SL-1細(xì)胞核的提取制備
        2.2.7 SL-1內(nèi)源性細(xì)胞色素C激活無細(xì)胞體系閾值確定
        2.2.8 形態(tài)學(xué)觀察細(xì)胞核凋亡情況
        2.2.9 用熒光定量分析法檢測SL-1細(xì)胞核凋亡后caspase-3的活性
        2.2.10 真核表達(dá)載體的構(gòu)建與轉(zhuǎn)染
        2.2.11 目的基因SL-1 Cytc與pIE1-EGFP-N1和pIE1-EGFP-C1連接
        2.2.12 Mito-Tracker Red CMXRos標(biāo)記線粒體
        2.2.13 細(xì)胞流式技術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率
3. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
    3.1 SL-1 Cytc蛋白的純化
    3.2 SL-1 Cytc多克隆抗體的制備及檢測
    3.3 斜紋夜蛾內(nèi)源性細(xì)胞色素C在無細(xì)胞體系中對細(xì)胞凋亡的影響
        3.3.1 SL-1細(xì)胞核于無細(xì)胞凋亡體系中凋亡形態(tài)學(xué)觀察
        3.3.2 熒光分光光度計(jì)法檢測內(nèi)源性Cyt C在無細(xì)胞凋亡體系中對caspase-3的活性的變化
    3.4 構(gòu)建Cyt C真核表達(dá)載體,將其轉(zhuǎn)染到S1-1細(xì)胞中研究其功能
    3.5 真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染SL-1細(xì)胞后,運(yùn)用熒光定量法和細(xì)胞流式技術(shù)檢測細(xì)胞色素C對細(xì)胞凋亡的作用
4. 討論
參考文獻(xiàn)
致謝



本文編號：4040362