棉鈴蟲(Helicoverpa armigera)屬鱗翅目夜蛾科昆蟲,寄主范圍非常廣,是一種危害嚴(yán)重的世界性農(nóng)業(yè)害蟲。棉鈴蟲的防治主要以化學(xué)防治為主,長期的依賴化學(xué)農(nóng)藥,不可避免的對農(nóng)藥產(chǎn)生抗性。用藥成本增加,治理難度加大。羧酸酯酶(CarE)屬于昆蟲體內(nèi)一種重要的解毒酶系,它的存在與抗藥性的產(chǎn)生機(jī)制有關(guān)。本研究從棉鈴蟲中腸提取RNA,克隆羧酸酯酶基因全長序列。并將獲得的WH001d目的基因去除信號肽,經(jīng)雙酶切后與表達(dá)載體pET-32a(+)連接,轉(zhuǎn)化到E.coli BL21(DE3)菌株中。重組載體用IPTG低溫誘導(dǎo)表達(dá),經(jīng)SDS-PAGE檢測,證明WH001d成功得到表達(dá)。進(jìn)一步通過用Ni2+NTA親和層析柱純化,獲得較純的WH001d酶蛋白。優(yōu)化表達(dá)條件,獲得可溶性酯酶的表達(dá)水平,為后期通過酯酶體外定向進(jìn)化提高其對有機(jī)磷殺蟲劑的解毒活性及構(gòu)建解毒酶工程菌奠定前期基礎(chǔ)。主要結(jié)果如下：1.經(jīng)TA克隆,獲得棉鈴蟲WH001a, WH001d, WH001h, WHOOlg完整編碼序列,長度分別為1665 bp,1662 bp,1665 bp,2241 bp。通過基因克隆得到WH001b,...

【文章頁數(shù)】：42 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
第一章 文獻(xiàn)綜述
    1.1 前言
    1.2 棉鈴蟲分部與危害
    1.3 羧酸酯酶概況
        1.3.1 羧酸酯酶分類與命名
        1.3.2 羧酸酯酶結(jié)構(gòu)功能機(jī)水解機(jī)制
    1.4 抗藥性機(jī)理
        1.4.1 代謝抗性的分子基礎(chǔ)
        1.4.2 羧酸酯酶的抗藥性機(jī)制
    1.5 棉鈴蟲羧酸酯酶與抗性的研究進(jìn)展
    1.6 研究目的和意義
    1.7 技術(shù)路線
第二章 材料與方法
    2.1 供試材料
        2.1.1 供試?yán)ハx
        2.1.2 菌種
        2.1.3 主要試劑
        2.1.4 溶液配制及培養(yǎng)基
        2.1.5 SDS-PAGE電泳試劑
        2.1.6 Ni-NTA親和層析緩沖液配制
        2.1.7 測定蛋白濃度試劑
    2.2 試驗(yàn)方法
        2.2.1 羧酸酯酶基因克隆
        2.2.2 構(gòu)建重組表達(dá)載體
        2.2.3 原核表達(dá)
        2.2.4 Ni²+親和柱層析
        2.2.5 SDS-PAGE檢測
        2.2.6 Bradford法測定蛋白濃度
第三章 結(jié)果與分析
    3.1 棉鈴蟲羧酸脂酶基因克隆和序列比對特征分析
    3.2 重組表達(dá)載體的構(gòu)建
    3.3 誘導(dǎo)蛋白表達(dá),純化和檢測
        3.3.1 純化蛋白SDS-PAGE檢測
        3.3.2 蛋白純化后的濃度測定
第四章 問題與討論
第五章 總結(jié)
參考文獻(xiàn)
附錄
致謝
作者簡介



本文編號：4013028