小菜蛾P(guān)lutella xylostella L屬鱗翅目菜蛾科,作為世界性分布的十字花科蔬菜主要害蟲,也是抗藥性產(chǎn)生最快和最強(qiáng)的農(nóng)業(yè)害蟲之一。自1953年小菜蛾被報(bào)道成為世界上第一個(gè)對(duì)DDT產(chǎn)生抗性的作物害蟲以來(lái),已對(duì)多種殺蟲劑產(chǎn)生抗性,其中以對(duì)擬除蟲菊酯類殺蟲劑的抗性發(fā)展最快。小菜蛾抗藥性的產(chǎn)生和不斷增強(qiáng)帶來(lái)一系列的危害,農(nóng)業(yè)減產(chǎn)、環(huán)境污染、傷害天敵、甚至危害人類的健康和生態(tài)平衡。因此,小菜蛾抗性機(jī)理方面的研究刻不容緩。 溴氰菊酯（deltamethrin, DM）是人工合成擬除蟲菊酯殺蟲劑中殺蟲毒力最強(qiáng)的品種之一,對(duì)哺乳動(dòng)物安全,具有廣譜、低殘留的特點(diǎn),在生產(chǎn)實(shí)踐中得到了廣泛應(yīng)用。我們前期的研究發(fā)現(xiàn),小菜蛾溴氰菊酯敏感品系和抗性品系成蟲期的蛋白質(zhì)雙向電泳圖譜存在顯著差異。但是,小菜蛾的主要危害是在幼蟲期,而且同一蛋白在不同生理階段表達(dá)水平也有很大差異,因此分析幼蟲在溴氰菊酯脅迫下蛋白質(zhì)表達(dá)譜的變化,不僅有助于闡述抗性機(jī)理,分析交互抗性,還有望篩選出殺蟲劑的分子靶標(biāo)。本文在前期工作的基礎(chǔ)上,采用雙向電泳和質(zhì)譜技術(shù)對(duì)小菜蛾幼蟲體內(nèi)差異表達(dá)的蛋白質(zhì)進(jìn)行分離和鑒定,通過(guò)基因轉(zhuǎn)染技術(shù)進(jìn)... 

【文章頁(yè)數(shù)】：62 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
第1章 緒論
    1.1 小菜蛾抗性發(fā)展現(xiàn)狀
    1.2 小菜蛾對(duì)農(nóng)藥抗性的研究
        1.2.1 有機(jī)磷類
        1.2.2 擬除蟲菊酯類
        1.2.3 氨基甲酸酯類
        1.2.4 沙蠶毒素類
        1.2.5 抗生素阿維菌素類
        1.2.6 蘇云金桿菌類
    1.3 小菜蛾的抗藥性機(jī)制
        1.3.1 解毒酶活性增加
        1.3.2 靶標(biāo)敏感度降低
    1.4 蛋白質(zhì)組學(xué)研究
        1.4.1 蛋白質(zhì)組學(xué)研究策略
        1.4.2 蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)
            1.4.2.1 蛋白質(zhì)分離技術(shù)
            1.4.2.2 蛋白質(zhì)鑒定技術(shù)
        1.4.3 蛋白質(zhì)組學(xué)在昆蟲抗藥性方面的研究
    1.5 基因轉(zhuǎn)染技術(shù)
第2章 小菜蛾幼蟲體內(nèi)差異表達(dá)蛋白的分離與鑒定
    2.1 實(shí)驗(yàn)材料
        2.1.1 供試小菜蛾
        2.1.2 主要試劑
        2.1.3 主要儀器
    2.2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.2.1 試劑配制
        2.2.2 蛋白樣品制備
            2.2.2.1 小菜蛾幼蟲總蛋白的提取
            2.2.2.2 蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備和濃度檢測(cè)
        2.2.3 雙向電泳
            2.2.3.1 第一向等電聚焦(IEF)
            2.2.3.2 第二向SDS-PAGE電泳
        2.2.4 圖像采集與分析
            2.2.4.1 銀染
            2.2.4.2 凝膠掃描與圖像分析
        2.2.5 質(zhì)譜鑒定
            2.2.5.1 取點(diǎn)
            2.2.5.2 膠內(nèi)酶解
            2.2.5.3 MALDI-TOF-TOF 質(zhì)譜
    2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        2.3.1 蛋白質(zhì)樣品的濃度測(cè)定
        2.3.2 小菜蛾幼蟲的雙向電泳圖譜
        2.3.3 差異蛋白點(diǎn)的質(zhì)譜鑒定結(jié)果
    2.4 討論
        2.4.1 雙向電泳圖譜分析
        2.4.2 質(zhì)譜鑒定結(jié)果分析
第3章 應(yīng)用qRT-PCR技術(shù)驗(yàn)證小菜蛾幼蟲體內(nèi)差異蛋白質(zhì)的表達(dá)
    3.1 實(shí)驗(yàn)材料
        3.1.1 供試小菜蛾
        3.1.2 主要試劑
        3.1.3 主要儀器
    3.2 實(shí)驗(yàn)方法
        3.2.1 提取小菜蛾幼蟲總RNA
        3.2.2 檢測(cè)RNA的濃度和純度
        3.2.3 合成cDNA
        3.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR
        3.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析
    3.3 結(jié)果
        3.3.1 RNA樣品的測(cè)定
        3.3.2 qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果
        3.3.3 差異點(diǎn)蛋白的表達(dá)分析
    3.4 討論
第4章 TCTP過(guò)表達(dá)對(duì)Kc細(xì)胞溴氰菊酯敏感性的影響
    4.1 實(shí)驗(yàn)材料
        4.1.1 供試小菜蛾
        4.1.2 果蠅Kc細(xì)胞
        4.1.3 主要試劑和儀器
        4.1.4 主要儀器
    4.2 實(shí)驗(yàn)方法
        4.2.1 TCTP目的基因的制備
            4.2.1.1 提取小菜蛾幼蟲總RNA
            4.2.1.2 合成cDNA
            4.2.1.3 PCR擴(kuò)增目的基因片段
        4.2.2 構(gòu)建重組質(zhì)粒
            4.2.2.1 PCR產(chǎn)物純化
            4.2.2.2 構(gòu)建pIB-TCTP重組質(zhì)粒
            4.2.2.3 鑒定重組質(zhì)粒
        4.2.3 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染Kc細(xì)胞
            4.2.3.1 抽提質(zhì)粒
            4.2.3.2 Kc細(xì)胞接種6孔板
            4.2.3.3 轉(zhuǎn)染Kc細(xì)胞
        4.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)目的基因表達(dá)
            4.2.4.1 提取細(xì)胞RNA
            4.2.4.2 逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA
            4.2.4.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR
        4.2.5 細(xì)胞毒性檢測(cè)
    4.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        4.3.1 PCR擴(kuò)增目的基因
        4.3.2 重組質(zhì)粒pIB-TCTP的鑒定
        4.3.3 TCTP基因的表達(dá)分析
        4.3.4 細(xì)胞活力分析
    4.4 討論
第5章 總結(jié)
參考文獻(xiàn)
在讀學(xué)位期間的研究成果及發(fā)表的學(xué)術(shù)論文
致謝


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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