蘇云金芽胞桿菌（Bacillus thuringiensis,以下簡稱Bt）是革蘭氏陽性細(xì)菌,由于其在生長代謝過程中會產(chǎn)生對許多靶標(biāo)害蟲具有特異殺蟲活性且對環(huán)境友好、對人畜無害的殺蟲蛋白。已成為在世界范圍內(nèi)應(yīng)用最為廣泛的微生物殺蟲劑之一。近年來,隨著Bt制劑的用量逐年增大和轉(zhuǎn)Bt基因植物種植面積的擴(kuò)大,害蟲種群對Bt殺蟲蛋白產(chǎn)生抗性的問題也愈發(fā)嚴(yán)重。同時,Bt殺蟲劑殺蟲范圍有限,持效時間短以及易受溫度、紫外線等環(huán)境影響的問題也逐漸暴露出來。因此優(yōu)良Bt菌株的分離篩選和Bt新型基因的發(fā)掘具有重要的研究價值和實際應(yīng)用意義。本研究從遼寧省不同地區(qū)的山丘、農(nóng)田和城市侵蝕地共采集524份土樣,從中分離出66株野生菌株,伴胞晶體形狀有球形、橢圓形、短雙錐形、菱形以及不規(guī)則形等。利用PCR-RFLP方法對分離株的基因型進(jìn)行鑒定,在分離株中檢測出cry1Ac、cry2Aa、cry8E、cry8F四種基因型。單菌株中基因的組合類型也較為豐富,包括cry1Ac+cry8E、cry2Aa+cry8E及cry1Ac+cry2Aa+cry8E等,充分體現(xiàn)了遼寧省Bt資源的多樣性。提取Bt分離株總蛋白,對鱗翅目害... 

【文章來源】：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)黑龍江省 211工程院校

【文章頁數(shù)】：64 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

Cry蛋白的保守結(jié)構(gòu)域[92]

引 言自 1985 年至 2018 年，經(jīng)過三十幾年的發(fā)掘與篩選，Cry 蛋白已經(jīng)被研究者們分為 78個不同類型（Cry1 到 Cry78），包含來源于 Bt 和其他芽胞桿菌的 3D 蛋白和 ETX_MTX2 家族蛋白。Cry 類蛋白質(zhì)家族可分為三種類別：3D-Cry 毒素家族、Bin 毒素家族和 Mtx 毒素家族[41-42]。3D-Cry 毒素家族是 Cry 蛋白家族中最大并且研究最為廣泛的類群，在該類群的蛋白結(jié)構(gòu)具有高度相似的 3D 結(jié)構(gòu)。結(jié)構(gòu)域 I 是七個 -螺旋簇構(gòu)成，主要與細(xì)胞膜的插入，毒素的活化和孔道形成有關(guān)。結(jié)構(gòu)域 II 是一個反向平行的 β 折疊片構(gòu)成，平行的 β-折疊結(jié)構(gòu)包裹在疏水核心周圍，其暴露的環(huán)形區(qū)域則參與受體識別。結(jié)構(gòu)域 III 是兩個反平行的 β-折疊片，結(jié)構(gòu)域 II 和 III 都是通過識別特異性受體對昆蟲產(chǎn)生特異性反應(yīng)的結(jié)構(gòu)[43-48]。Domain I、Domain II 和 Domain III 的結(jié)構(gòu)如圖 1-3 所示。

圖 1-4 Cry 毒素殺蟲的作用原理Fig.1-4 The principle of Cry toxins insecticidal actionBin 毒素存在于具有較高殺蚊活性的球形芽孢桿菌（Lysinibacillus sphaericus）產(chǎn)生的晶體中。晶體由兩個獨立但同源的蛋白質(zhì) BinA（42 kDa）和 BinB（51 kDa）組成，并且在芽胞形成之初沉積在外生孢子內(nèi)。異源表達(dá)的這兩種蛋白都對蚊子幼蟲具有毒殺作用，并且等摩爾比例混合的蛋白具有最高的活性[60-62]。重組 Bt 菌株中產(chǎn)生的 BinA 本身也具有毒性，B毒素在目標(biāo)昆蟲的中腸中被蛋白水解酶水解和激活，毒素與靶昆蟲腸道上皮特異性受體結(jié)合[63-64]。報道指出克隆淡色庫蚊幼蟲的受體與大小 60 kDa 的 GPI 錨定膜 -葡糖苷酶結(jié)合后，上皮細(xì)胞出現(xiàn)各種超微結(jié)構(gòu)改變，導(dǎo)致膜孔形成，用人造膜進(jìn)行的體外測定顯示，主要是蛋白質(zhì) BinA 以及 BinB 的輔助引起膜通道形成[65]。BinA 和 BinB 是高度同源的蛋白，但是在化過程中功能似乎已經(jīng)發(fā)生了分歧，其中 BinA 作用于通道形成，而 BinB 作用于受體結(jié)合[66同球形芽胞桿菌產(chǎn)生的殺蚊毒素較為相似的還有 Mtx 毒素，Mtx 毒素以 MTX 為保守構(gòu)域。Cry15，Cry23，Cry33，Cry38，Cry45 等毒素都屬于含有 MTX 為保守結(jié)構(gòu)域的 M毒素家族。蘇云金芽胞桿菌 Cry15Aa 蛋白與 Mtx2 和 Mtx3 具有同源性，能夠?qū)[翅目煙草天蛾顯示出毒殺活性，并且在晶體中發(fā)現(xiàn)分子量為 40 kDa 的蛋白，該蛋白本身并沒有殺蟲活性也不影響 Cry15A 對煙草天蛾的毒殺活性，但它卻能大大增強(qiáng)對蘋果蠹蛾的活性。Mtx2，Mt營養(yǎng)期產(chǎn)生毒素對致倦庫蚊和埃及伊蚊表現(xiàn)出殺蚊活性[67-68]。Mtx2 毒素對兩種蚊子的作用是不同的，研究表明 Mtx2 毒素的 224 位氨基酸是決定最佳殺蟲目標(biāo)的關(guān)鍵部位，賴氨酸在這

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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碩士論文
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本文編號：3503494