本文關(guān)鍵詞：東方粘蟲U6啟動(dòng)子的克隆及對(duì)V-ATPase B亞基基因沉默的研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：RNA干擾(RNA interference,RNAi)技術(shù)不僅可以用于昆蟲基因功能的研究,還可以用于田間害蟲的防治。V-ATP酶(vacular-type ATPase,V-ATPase)是生物體內(nèi)普遍存在的一種酶,它是以水解ATP為能量跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)H+的質(zhì)子泵,為生物體保持正常的功能發(fā)揮著重要作用。對(duì)V-ATPase基因的任何干擾都會(huì)影響它的活性,進(jìn)而影響生物的生存。U6啟動(dòng)子是介導(dǎo)小干擾RNA(small interference RNA,si RNA)表達(dá)的啟動(dòng)子,其驅(qū)動(dòng)的短發(fā)夾RNA(short hairpin,shRNA)表達(dá)載體能在細(xì)胞內(nèi)合成大量的siRNA,導(dǎo)致目的基因沉默。本研究利用染色體步移(Chromosome Walking)技術(shù)克隆得到東方粘蟲(Mythimna separata)U6啟動(dòng)子序列,并通過生物信息學(xué)及細(xì)胞轉(zhuǎn)染的方法對(duì)該序列進(jìn)行分析和功能驗(yàn)證。該序列全長(zhǎng)1 426 bp,包含八聚體序列(OCT),SPH元件,遠(yuǎn)端序列元件(DSE),近端序列元件(PSE)及TATAbox等RNA聚合酶Ⅲ啟動(dòng)子的特征元件。細(xì)胞轉(zhuǎn)染表明該序列能成功驅(qū)動(dòng)shRNA的表達(dá),具有U6啟動(dòng)子活性。根據(jù)東方粘蟲V-ATPase B亞基基因序列,設(shè)計(jì)并獲得shRNA,將其與U6啟動(dòng)子構(gòu)建到昆蟲桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體上,得到重組昆蟲桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體,并通過細(xì)胞轉(zhuǎn)染的方式獲得包含目的基因的昆蟲桿狀病毒。PCR及測(cè)序結(jié)果表明重組桿狀病毒能夠穩(wěn)定遺傳。通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測(cè)了重組桿狀病毒對(duì)東方粘蟲V-ATPase B亞基基因的影響。結(jié)果顯示,B亞基基因相對(duì)表達(dá)量顯著降低,表明重組桿狀病毒能在東方粘蟲體內(nèi)繁殖并表達(dá)目的基因。本研究成功克隆了東方粘蟲的U6啟動(dòng)子,并構(gòu)建了由其驅(qū)動(dòng)的昆蟲桿狀病毒表達(dá)載體,得到了具有沉默東方粘蟲V-ATPase B亞基基因效應(yīng)的桿狀病毒,同時(shí)也證明了該桿狀病毒具有遺傳穩(wěn)定性,為利用RNAi技術(shù)防治東方粘蟲及其他害蟲提供了參考。
【關(guān)鍵詞】：東方粘蟲 V-ATPase RNAi U6啟動(dòng)子
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S433.4
【目錄】：

• 摘要6-7
• ABSTRACT7-10
• 第一章 文獻(xiàn)綜述10-17
• 1.1 前言10
• 1.2 東方粘蟲概述10-11
• 1.3 昆蟲的V-ATPase11
• 1.4 RNAi技術(shù)的機(jī)制及應(yīng)用11-14
• 1.4.1 RNAi現(xiàn)象的概述11-12
• 1.4.2 RNAi技術(shù)的分子機(jī)制12-13
• 1.4.3 RNAi技術(shù)的特點(diǎn)及應(yīng)用13-14
• 1.5 RNA聚合酶III啟動(dòng)子14-16
• 1.5.1 RNA聚合酶III啟動(dòng)子的分類與結(jié)構(gòu)15
• 1.5.2 RNA聚合酶III啟動(dòng)子的應(yīng)用15-16
• 1.6 本研究的目的與意義16-17
• 第二章 東方粘蟲U6啟動(dòng)子的克隆及功能驗(yàn)證17-29
• 2.1 前言17
• 2.2 材料與試劑17-18
• 2.2.1 主要材料與試劑17
• 2.2.2 主要儀器17-18
• 2.3 試驗(yàn)方法18-21
• 2.3.1 染色體步移引物設(shè)計(jì)與合成18
• 2.3.2 東方粘蟲基因組DNA的提取18
• 2.3.3 染色體步移文庫(kù)的建立18
• 2.3.4 PCR擴(kuò)增18-20
• 2.3.5 PCR產(chǎn)物純化20
• 2.3.6 測(cè)序20
• 2.3.7 U6啟動(dòng)子的shEGFP重組載體的構(gòu)建20-21
• 2.4 結(jié)果分析21-27
• 2.4.1 巢式PCR21-23
• 2.4.2 U6 snRNA基因上游 5′側(cè)翼序列分析23-25
• 2.4.3 pMD18-N載體的雙酶切檢測(cè)25
• 2.4.4 shEGFP的獲得25-26
• 2.4.5 U6啟動(dòng)子的克隆及載體的構(gòu)建26-27
• 2.4.6 RNAi載體轉(zhuǎn)染 293T細(xì)胞的熒光顯微鏡檢測(cè)27
• 2.5 小結(jié)與討論27-29
• 第三章 昆蟲桿狀病毒表達(dá)載體的構(gòu)建29-43
• 3.1 前言29
• 3.2 材料與試劑29
• 3.2.1 主要材料29
• 3.2.2 主要儀器29
• 3.3 實(shí)驗(yàn)方法29-34
• 3.3.1 昆蟲桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體的構(gòu)建29-32
• 3.3.2 重組昆蟲桿狀病毒的轉(zhuǎn)染32-33
• 3.3.3 重組昆蟲桿狀病毒遺傳穩(wěn)定性33-34
• 3.4 結(jié)果分析34-41
• 3.4.1 pBacPAK9-的獲得34-35
• 3.4.2 U6-的獲得35
• 3.4.3 BshRNA的獲得35-36
• 3.4.4 昆蟲桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體的構(gòu)建36-37
• 3.4.5 重組昆蟲桿狀病毒37-38
• 3.4.6 重組昆蟲桿狀病毒遺傳穩(wěn)定性38-40
• 3.4.7 對(duì)東方粘蟲RNAi效果檢測(cè)40-41
• 3.5 小結(jié)與討論41-43
• 第四章 結(jié)論43-44
• 參考文獻(xiàn)44-49
• 附錄49-55
• 縮略詞55-56
• 致謝56-57
• 作者簡(jiǎn)介57

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1 王高振;東方粘蟲U6啟動(dòng)子的克隆及對(duì)V-ATPase B亞基基因沉默的研究[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2016年

  本文關(guān)鍵詞：東方粘蟲U6啟動(dòng)子的克隆及對(duì)V-ATPase B亞基基因沉默的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：335798