本文關(guān)鍵詞：鹽生草鹽脅迫響應(yīng)基因Unigene7547的克隆及在煙草中轉(zhuǎn)化的初步研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：鹽漬化是一種顯著非生物脅迫,對我國資源環(huán)境產(chǎn)生了嚴重的影響。鹽脅迫限制著植物的生長發(fā)育、蛋白質(zhì)的合成、光合作用的進行及代謝活動等,影響其整個生命周期,是重要的非生物逆境因素。鹽生植物因其具有豐富的抗鹽堿基因庫及在鹽堿土地中生長良好而改善土地狀況等特性,引起了當今科研人員的高度重視。鹽生草(Halogeton glomeratus)為藜科鹽生草屬一年生鹽生植物,在我國主要分布在西北大部分省份、內(nèi)蒙古、東北以西地區(qū)等。其具有適應(yīng)干旱、鹽堿、高溫等嚴酷環(huán)境的特點,地上多分枝的莖和葉的肉質(zhì)化程度較高,具有較強的保持水土、防風(fēng)固沙、耐鹽和抗旱的能力。鹽生草是獲取耐鹽基因的優(yōu)良野生資源,在鹽漬荒漠地區(qū)改良土壤和環(huán)境問題等方面起著決定性的作用。本研究的主要內(nèi)容與實驗結(jié)果如下:1.基于鹽生草轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果,篩選出表達上調(diào)較高的基因Unigene7547并設(shè)計引物,在鹽生草中成功克隆Unigene7547基因全序列。該序列全長為1306 bp,包含1218bp的ORF,編碼405個氨基酸,分子量為45.16 kDa。蛋白呈酸性,屬于不穩(wěn)定蛋白質(zhì)。2.Unigene7547基因編碼蛋白定位于細胞核內(nèi)可信度高達0.600,線粒體基質(zhì)內(nèi)可信度達0.100,溶酶體內(nèi)可信度達0.100,微體內(nèi)可信度達0.018。該蛋白為親水性蛋白,無跨膜區(qū)域。不存在信號肽,為非分泌型蛋白。預(yù)測該蛋白在細胞核內(nèi)表達。我們發(fā)現(xiàn)Unigene7547中Thr、Ser、Tyr分別含有8、8、5個磷酸化位點,可能影響細胞生理活動和修飾調(diào)控等方面功能。二級結(jié)構(gòu)中隨機卷曲、延伸鏈、α螺旋、β-轉(zhuǎn)角分別為37.78%、28.89%、23.46%、9.88%。進行BLAST同源性比對后,沒有發(fā)現(xiàn)與Unigene7547基因cDNA全序列匹配的序列且該基因為首次發(fā)現(xiàn),因此推測其為新基因。綜合以上分析表明,僅對鹽生草Unigene7547基因編碼蛋白的生物性狀進行了淺層次的研究,為后續(xù)實驗的開展提供了理論依據(jù),但相關(guān)特殊功能有待進一步研究。3.采用常規(guī)分子克隆技術(shù),設(shè)計含有XbaⅠ和SmaⅠ酶切位點的特異性引物,用其對Unigene7547基因和植物表達載體pBI121質(zhì)粒進行雙酶切,再用T4 DNA Ligase連接,構(gòu)建了植物表達載體pBI-Unigene7547。將pBI-Unigene7547導(dǎo)入農(nóng)桿菌中,并介導(dǎo)煙草葉片,得到抗性植株。經(jīng)PCR擴增后電泳檢測結(jié)果表明,可初步判定Unigene7547基因已成功轉(zhuǎn)入煙草,這一結(jié)果為該基因相關(guān)功能的驗證提供了幫助,也為其在提升栽培作物抗鹽性等方面做好了準備。
【關(guān)鍵詞】：鹽生草 Unigene7547基因 植物表達載體 轉(zhuǎn)基因煙草
【學(xué)位授予單位】：甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：Q943.2;S156.4
【目錄】：

• 摘要2-3
• Summary3-9
• 縮略詞表9-10
• 第一章 文獻綜述10-19
• 1.1 土壤鹽堿化的現(xiàn)狀與危害10
• 1.2 鹽脅迫對植物的影響10-14
• 1.2.1 鹽脅迫對植物生長發(fā)育的影響10-11
• 1.2.2 鹽脅迫對植物的生理傷害11-12
• 1.2.2.1 鹽脅迫下的滲透脅迫11
• 1.2.2.2 鹽脅迫下的離子毒害11-12
• 1.2.2.3 鹽脅迫下氧化脅迫對植物的影響12
• 1.2.3 鹽脅迫對植物激素的影響12-13
• 1.2.4 鹽脅迫對植物光合作用的影響變化13-14
• 1.3 植物的耐鹽機制14-16
• 1.3.1 鹽脅迫種子萌發(fā)的機理14
• 1.3.2 鹽脅迫下滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的作用14-15
• 1.3.3 植物體內(nèi)離子選擇性吸收和區(qū)隔化15
• 1.3.4 鹽生植物與非鹽生植物耐鹽機制差異15-16
• 1.4 植物耐鹽相關(guān)基因的研究進展16-17
• 1.4.1 離子轉(zhuǎn)運相關(guān)基因16
• 1.4.2 滲透調(diào)節(jié)相關(guān)基因16
• 1.4.3 鹽脅迫信號傳導(dǎo)基因及表達調(diào)節(jié)相關(guān)功能基因16
• 1.4.4 與細胞排毒、抗氧化性相關(guān)的酶基因16-17
• 1.4.5 保護細胞免受脅迫傷害的相關(guān)功能蛋白基因17
• 1.5 研究目的和意義17-18
• 1.6 技術(shù)路線18-19
• 第二章 鹽生草Unigene7547基因的克隆及序列分析19-35
• 2.1 試驗材料與試劑19-20
• 2.1.1 試驗材料19
• 2.1.2 試劑及常用酶19
• 2.1.3 引物設(shè)計19
• 2.1.4 培養(yǎng)基19-20
• 2.1.5 菌株與克隆載體20
• 2.1.6 儀器與設(shè)備20
• 2.2 試驗方法20-26
• 2.2.1 鹽生草總RNA的提取20-21
• 2.2.2 cDNA第一鏈的合成21
• 2.2.3 鹽生草Unigene7547基因的克隆21-24
• 2.2.3.1 鹽生草Unigene7547基因核心片段的克隆21-22
• 2.2.3.2 鹽生草Unigene7547基因 3' Racer的克隆22
• 2.2.3.3 鹽生草Unigene7547基因 5' Racer的克隆22-24
• 2.2.4 基因的測序及全長序列的拼接24-25
• 2.2.4.1 PCR產(chǎn)物回收純化24-25
• 2.2.4.2 連接克隆載體25
• 2.2.4.3 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α25
• 2.2.4.4 藍白斑的篩選及測序25
• 2.2.4.5 基因全長拼接25
• 2.2.5 目的基因的生物信息學(xué)分析25-26
• 2.3 結(jié)果與分析26-33
• 2.3.1 總RNA的提取26
• 2.3.2 鹽生草Unigene7547基因的克隆及序列拼接26-29
• 2.3.3 Unigene7547基因的生物信息學(xué)分析29-33
• 2.3.3.1 Unigene7547基因編碼蛋白理化性質(zhì)預(yù)測29
• 2.3.3.2 Unigene7547基因編碼蛋白亞細胞定位29-30
• 2.3.3.3 Unigene7547基因編碼蛋白的跨膜區(qū)和疏水性分析30-31
• 2.3.3.4 Unigene7547基因編碼蛋白信號肽預(yù)測31-32
• 2.3.3.5 Unigene7547基因編碼蛋白的磷酸化位點預(yù)測32
• 2.3.3.6 Unigene7547基因編碼蛋白的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測32-33
• 2.4 討論33-35
• 2.4.1 鹽生草Unigene7547基因的克隆33
• 2.4.2 鹽生草Unigene7547基因的生物信息學(xué)分析33-35
• 第三章 鹽生草Unigene7547基因表達載體構(gòu)建與遺傳轉(zhuǎn)化35-50
• 3.1 試驗材料和試劑35
• 3.1.1 試劑與工具酶35
• 3.1.2 培養(yǎng)基35
• 3.1.3 植物表達載體和菌株35
• 3.2 試驗方法35-41
• 3.2.1 引物設(shè)計35
• 3.2.2 克隆目的基因35-36
• 3.2.2.1 目的片段的擴增35-36
• 3.2.2.2 回收純化目的片段36
• 3.2.2.3 回收產(chǎn)物加A尾36
• 3.2.3 回收產(chǎn)物連接克隆載體36-37
• 3.2.4 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α37
• 3.2.5 陽性重組子的篩選與測序37
• 3.2.6 重組質(zhì)粒的鑒定37-38
• 3.2.6.1 重組質(zhì)粒的小量提取37-38
• 3.2.6.2 重組質(zhì)粒的PCR鑒定38
• 3.2.7 構(gòu)建植物表達載體pBI-Unigene754738-39
• 3.2.7.1 質(zhì)粒的雙酶切38-39
• 3.2.7.2 目的片段與載體pBI121連接39
• 3.2.7.3 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α39
• 3.2.7.4 藍白斑的篩選與測序39
• 3.2.7.5 重組質(zhì)粒的PCR鑒定和雙酶切鑒定39
• 3.2.8 pBI-Unigene7547轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌39-40
• 3.2.8.1 農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞LBA4404的制備39-40
• 3.2.8.2 將重組質(zhì)粒pBI-Unigene7547轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌40
• 3.2.8.3 陽性克隆的篩選及抗性菌落PCR檢測40
• 3.2.9 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的煙草轉(zhuǎn)化40-41
• 3.2.9.1 煙草葉片組織培養(yǎng)40
• 3.2.9.2 農(nóng)桿菌的活化與制備40-41
• 3.2.9.3 農(nóng)桿菌浸染煙草葉片41
• 3.2.9.4 轉(zhuǎn)基因煙草的檢測41
• 3.3 結(jié)果與分析41-48
• 3.3.1 克隆目的基因41-45
• 3.3.2 構(gòu)建植物表達載體45-46
• 3.3.2.1 植物表達載體pBI- Unigene7547的構(gòu)建45
• 3.3.2.2 植物表達載體pBI- Unigene7547的鑒定45-46
• 3.3.3 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的煙草轉(zhuǎn)化46-48
• 3.3.3.1 重組質(zhì)粒pBI-Unigene7547的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化46-47
• 3.3.3.2 農(nóng)桿菌浸染煙草葉片組織47-48
• 3.3.3.3 轉(zhuǎn)基因煙草的檢測48
• 3.4 討論48-50
• 結(jié)論50-51
• 參考文獻51-58
• 致謝58-59
• 作者簡介59-60
• 導(dǎo)師簡介60-61

【參考文獻】

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  本文關(guān)鍵詞：鹽生草鹽脅迫響應(yīng)基因Unigene7547的克隆及在煙草中轉(zhuǎn)化的初步研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：321761