【摘要】：類病毒是一類共價閉合的環(huán)狀單鏈RNA,不編碼任何蛋白質(zhì),其基因組大小在246-434 nt范圍內(nèi)。類病毒自身的穩(wěn)定性強,不容易被脫氧核糖核酸酶降解。它是迄今發(fā)現(xiàn)最小的能進行自我復制的遺傳因子。在自然界中,可引起十分嚴重的植物病害。國際病毒分類委員會將目前已經(jīng)鑒定的44種類病毒分為兩個科,七個屬。本實驗中,我們選取了具有不同屬代表性的7種類病毒,它們分別是:馬鈴薯紡錘形塊莖類病毒(Potato spindle tuber viroid)、柑橘裂皮類病毒(Citrus exocortis viroid)、血莧類病毒1號(Iresine viroid 1)、蘋果銹果類病毒(Apple scar skin viroid)、啤酒花矮化類病毒(Hop stunt viroid)、桃潛花葉類病毒(Peach latent mosaic viroid)、鱷梨日斑類病毒(Avocado sunblotch viroid)。本研究所選用的絲狀真菌為板栗疫病病原菌,該菌是屬于子囊菌亞門、核菌綱、球殼菌目的寄生內(nèi)座殼(Cryphenctria.Parasitica)。本課題主要研究類病毒能否侵染栗疫病菌并在栗疫病菌中進行復制。此外,研究類病毒的侵染對宿主真菌的生長,發(fā)育和致病性的影響。本實驗為研究類病毒的宿主范圍,發(fā)病機制和潛在的生物控制用途提供了新的研究思路和科學依據(jù)。本實驗首先構(gòu)建七種類病毒的侵染性克隆,將類病毒的體外轉(zhuǎn)錄物通過機械摩擦侵染煙草檢驗其活性;并通過轉(zhuǎn)化的方法侵染酵母菌株,驗證類病毒是否能在酵母菌株中進行復制。通過原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化的方法將類病毒體外轉(zhuǎn)錄物人工導入C.Parasitica原生質(zhì)體細胞中,細胞再生后,在PDA培養(yǎng)基上篩選轉(zhuǎn)化子,提取栗疫病菌ssRNA,設(shè)計特異性引物,利用RT-PCR技術(shù)對類病毒的侵染情況進行檢測。觀察穩(wěn)定侵染的類病毒對寄主真菌的生長、發(fā)育及致病力的影響。主要的研究結(jié)果如下:1.構(gòu)建七種類病毒侵染性克隆:本實驗利用體外轉(zhuǎn)錄的方法,構(gòu)建了ASBVd HSVd IRVd PLMVd ASSVd IRVd CSVd七種類病毒的侵染性克隆質(zhì)粒,獲得體外轉(zhuǎn)錄類病毒RNA后,摩擦接種煙草檢測其活性,并驗證其是否能侵染酵母菌株AH109。2.檢測七種類病毒侵染絲狀真菌的能力:將七種供試類病毒導入C.Parasitica原生質(zhì)細胞后,利用RT-PCR技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn):ASBVd、HSVd、IRVd能夠在C.Parasitica中進行復制,其中類病毒ASBVd的復制相較其他兩種類病毒更為穩(wěn)定;ASBVd侵染的菌株經(jīng)過繼代培養(yǎng)后提取ssRNA進行RT-PCR檢測,實驗結(jié)果表明,ASBVd的復制量無明顯減少,其他兩種類病毒的復制量隨繼代次數(shù)的增加而逐步降低。3.分析ASBVd侵染對C.Parasitica的影響:類病毒侵染后,對栗疫病菌表型產(chǎn)生一定影響,菌株的生長速率及色素積累量等發(fā)生變化。4.分析ASBVd在真菌寄主中的傳播情況:ASBVd侵染C.Parasitica后,與真菌病毒相似,可通過寄主菌絲融合進行傳播。經(jīng)RT-PCR檢測證實,類病毒可從帶毒菌株傳播至無毒菌株;將ASBVd侵染的C.Parasitica置于光照下培養(yǎng)至菌株產(chǎn)孢后,進行單孢分離培養(yǎng),提取真菌ssRNA并利用RT-PCR技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn),類病毒可通過孢子進行傳播。5.分析ASBVd侵染真菌寄主后的遺傳變異情況:類病毒侵染栗疫病菌后,將菌株繼代培養(yǎng),提取第8代菌株ssRNA進行檢測并測序發(fā)現(xiàn),隨菌株繼代培養(yǎng)后,類病毒序列發(fā)生了突變。6.對比、分析ASBVd野生型與突變株系的侵染活力及對寄主真菌的影響:ASBVd突變株系侵染栗疫病菌后,菌株氣生菌絲的量增加,生長力無明顯變化,提取真菌ssRNA進行檢測,結(jié)果表明,ASBVd的復制量與野生型中相比有所降低,侵染活力有所下降。
【圖文】：

類病毒是一類十分重要的病原物，從物質(zhì)構(gòu)成上來說，它是一類裸露的沒有包被的單鏈環(huán)狀 RNA 分子；類病毒是目前研究報道中最小的復制因子（Grot al. 2010）。類病毒的基因組大小在 246-436 nt 范圍之內(nèi)，，基因組并不大（黃2007）。類病毒的寄主范圍在高等植物中十分廣泛，但在真菌、動物和原生它真核生物細胞中尚未發(fā)現(xiàn)。由于類病毒自身不能編碼蛋白質(zhì)，它的復制與須依賴于寄主的相關(guān)蛋白（郭 瑞 2006）。類病毒的二級結(jié)構(gòu)一般呈棍棒狀的堿基配對率很高，因此其結(jié)構(gòu)相對穩(wěn)定。大多類病毒的 RNA 結(jié)構(gòu)包含了5 個主要的功能區(qū)域（圖 1-1）：最左端的左手區(qū)(TL)和最右端的右手末端區(qū)(的致病區(qū)(P)、中央保守區(qū)(C)和可變區(qū)(V)（José-Antonio Daròs et al. 2006）。同的主要區(qū)域有各自不同的生物學功能，其中與類病毒所致病害的癥狀關(guān)系的區(qū)域為 P 區(qū)；主要控制類病毒復制相關(guān)因子的區(qū)域是 C 區(qū)；其中 TL 區(qū)和的保守序在類病毒的復制過程起著十分重要的作用，這一區(qū)域有利于復合酶Owens RA et al. 2006）。其中 V 區(qū)序列的可變性是最大的，即使是相近科的該區(qū)域中序列的相似程度也都小于 50%。研究表明，V 區(qū)部分序列的變化也類病毒的復制能力。

（Hostuviroid）：代表種有啤酒花矮化類病毒（Hop stunt viroid）；椰子死亡類病毒屬（Cocadviroid）：代表種有椰子死亡類病毒（Coconut cadang-cadang viroid）；蘋果銹果類病毒屬（Apscaviroid）：代表種有蘋果銹果類病毒（Apple scar skin viroid）錦紫蘇類病毒屬（Coleviroid）：代表種有錦紫蘇類病毒 1（Coleus blumei viroid 1）。鱷梨日斑類病毒科（Avsunviroidae）的全部類病毒分子在復制過程中會形成一種具有核酶活性的錘頭狀結(jié)構(gòu)，該科的類病毒分子在復制過程中能夠進行自我切割，他們以對稱型的滾環(huán)模式進行復制，其侵染植物后主要的復制和積累場所是植物的葉綠體，這一科的類病毒又可以細分為不同的四個屬，其主要的分類依據(jù)是類病毒分子中的 G+C 含量和分子處于最低自由能時的二級結(jié)構(gòu)特征(其中桿狀分子包含一些基環(huán)結(jié)構(gòu)或呈分支狀結(jié)構(gòu))，該科的類病毒主要分為鱷梨日斑類病毒屬（Avsunviroid）：代表種有鱷梨日斑類病毒（Avocado sunblotch viroid）；桃潛花葉類病毒屬（Pelamoviroid）：代表種有桃潛花葉類病毒（Peach latent mosaic viroid）。近年來新發(fā)現(xiàn)的茄潛隱類病毒屬(Elaviroid)也具有該科的分類特征（Flores R et al. 2004; HuY et al. 2002）。馬鈴薯紡錘塊莖科和鱷梨日斑科的類病毒成員有著不同的生理特性，具體的如（表 1-1）。
【學位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：S476.13

【相似文獻】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 鄭洪;類病毒研究進展[J];中學生物教學;2001年03期

2 ;《啤酒花潛隱類病毒檢疫鑒定方法》[J];品牌與標準化;2015年10期

3 郭立新;徐穎;蔡曹盛;;啤酒花潛隱類病毒研究進展[J];湖南農(nóng)業(yè)科學;2012年07期

4 王國平;;近期發(fā)現(xiàn)的果樹類病毒及其檢測方法[J];植物檢疫;1991年06期

5 瞿峰,田波;類病毒研究的近年進展[J];病毒學報;1993年03期

6 Diener TO;言穆琳;;病毒群像:類病毒[J];國外醫(yī)學(微生物學分冊);1985年02期

7 由雪娟;;類病毒的診斷和研究方法[J];植物檢疫;1985年01期

8 T、SANO;I、UYEDA;E、SHIKATA;T、MESHI;T、OHNO;Y、OKADA;曲存英;;由葡萄分離出的一種類似病毒(Viroid-Like)RNA與酒麻花矮化類病毒(HSV)具有高度的同源關(guān)聯(lián)[J];葡萄栽培與釀酒;1987年03期

9 陳薇;;新發(fā)現(xiàn)的皰疹類病毒[J];國外醫(yī)學情報;1987年04期

10 宋傳正;張渝英;楊開宇;;一種合成全鏈長類病毒cDNA的有效方法[J];生物工程學報;1988年02期

相關(guān)會議論文 前10條

1 張本利;劉光要;劉春芹;吳祖建;姜冬梅;李世訪;;棗樹類病毒的檢測及鑒定[A];中國植物病理學會2009年學術(shù)年會論文集[C];2009年

2 鄧叢良;趙煥生;呂玉峰;聶棱;梁新苗;汪萬春;;基于納米磁珠和Real time RT-PCR技術(shù)檢測葡萄類病毒[A];中國植物病理學會2011年學術(shù)年會論文集[C];2011年

3 張志想;彭山;姜冬梅;潘嵩;李世訪;;同時檢測四種葡萄類病毒的串聯(lián)多聚探針的構(gòu)建及應(yīng)用[A];中國植物病理學會2011年學術(shù)年會論文集[C];2011年

4 李世訪;;生命科學面臨的最大的挑戰(zhàn)是“令人大失所望”[A];新觀點新學說學術(shù)沙龍文集2：生命科學的思考與暢想[C];2006年

5 李世訪;姜冬梅;郭瑞;彭山;吳祖建;;中國葡萄類病毒基因多樣性分析及其新種的發(fā)現(xiàn)[A];中國植物病理學會2009年學術(shù)年會論文集[C];2009年

6 陳楓;丁明孝;梁鳳霞;蓋秀貞;張存s

本文編號：2701218