【摘要】：單價(jià)轉(zhuǎn)Cry1Ac基因抗蟲棉的大面積推廣成功的控制了棉鈴蟲的為害,并顯著減輕農(nóng)藥施用量及對環(huán)境的污染。但是,研究發(fā)現(xiàn)部分鱗翅目害蟲對單價(jià)轉(zhuǎn)基因棉產(chǎn)生了抗性,同時(shí)發(fā)現(xiàn)單價(jià)轉(zhuǎn)基因棉花對甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)等害蟲的防治效果不理想。為了延緩靶標(biāo)害蟲對抗蟲棉抗性的發(fā)展,以及擴(kuò)大轉(zhuǎn)基因抗蟲棉的防治譜,國際上開始使用雙價(jià)轉(zhuǎn)基因策略,即同一轉(zhuǎn)基因作物中表達(dá)兩種不同殺蟲機(jī)理的殺蟲蛋白,Cry2A類蛋白是雙基因策略中應(yīng)用的重要蛋白之一。鈣粘蛋白(Cadherin)是Cry1類蛋白在鱗翅目害蟲中腸的主要受體,但其與Cry2類蛋白的相互作用關(guān)系還不甚明確。本文通過檢測鈣粘蛋白被沉默以后甜菜夜蛾對Cry蛋白(Cry1Ac和Cry2Aa)的敏感性,檢驗(yàn)鈣粘蛋白多肽片段與兩種Cry蛋白的結(jié)合能力,以期闡明甜菜夜蛾Cad1b與兩種Cry蛋白間的作用關(guān)系,此外借助競爭性結(jié)合試驗(yàn),探究了雙價(jià)轉(zhuǎn)基因植物的潛在風(fēng)險(xiǎn)。主要研究結(jié)果如下:1.通過飼喂甜菜夜蛾初孵幼蟲ds Se Cad1b,對鈣粘蛋白基因進(jìn)行RNA干擾研究。結(jié)果表明:甜菜夜蛾初孵幼蟲取食ds Se Cad1b 24h后,鈣粘蛋白基因表達(dá)量顯著降低;鈣粘蛋白基因被沉默以后,甜菜夜蛾對Cry1Ac、Cry2Aa蛋白的敏感性下降,死亡率顯著降低。2.將體外表達(dá)并純化的鈣粘蛋白多肽片段Se Cad1b、Se CR7-8F、Se CR9-MPED分別與生物素標(biāo)記的Cry1Ac、Cry2Aa結(jié)合,發(fā)現(xiàn)三段多肽均可以與兩種蛋白特異性結(jié)合。3.將純化后對鈣粘蛋白多肽片段Se Cad1b、Se CR7-8F、Se CR9-MPED分別與Cry1Ac和Cry2Aa做同源性競爭和異源性競爭點(diǎn)雜交試驗(yàn)。同源競爭時(shí),兩種Cry蛋白在三個(gè)多肽片段上均存在競爭性結(jié)合,而異源競爭時(shí),Cry蛋白在多肽片段上不存在競爭性結(jié)合。綜上所述,本研究明確了甜菜夜蛾Se Cad1b基因作為Cry1Ac和Cry2Aa蛋白的受體功能,并且Cry1Ac和Cry2Aa在甜菜夜蛾Se Cad1b蛋白上存在不同的結(jié)合位點(diǎn)。本研究為闡述甜菜夜蛾對Cry蛋白的抗性機(jī)制研究奠定了理論基礎(chǔ),并對雙價(jià)轉(zhuǎn)基因作物的研制和開發(fā)具有重要意義。
[Abstract]:The application of monovalent Cry1Ac transgenic cotton successfully controlled the damage of Helicoverpa armigera and significantly reduced the amount of pesticide applied and the pollution to the environment. However, it was found that some Lepidoptera pests were resistant to monovalent transgenic cotton, and the control effect of monovalent transgenic cotton on insect pests such as Spodoptera exigua (Spodoptera exigua) was not satisfactory. In order to delay the development of target insect resistance to cotton and expand the control spectrum of transgenic cotton, bivalent transgenic strategy has been used in the world. Cry2A protein, which expresses two different insecticidal mechanisms in the same transgenic crop, is one of the important proteins used in the double gene strategy. Cadherin (Cadherin) is the main receptor of Cry1 proteins in the midgut of Lepidoptera pests, but its interaction with Cry2 proteins is not clear. In this paper, the sensitivity of Spodoptera exigua to Cry protein (Cry1Ac and Cry2Aa) after the silencing of cadherin was detected, and the binding ability of cadherin polypeptide fragment to two Cry proteins was tested in order to elucidate the interaction between Cad1b and two Cry proteins of Spodoptera exigua. In addition, the potential risk of bivalent transgenic plants was explored by competitive binding test. The main results are as follows: 1. The RNA interference of cadherin gene was studied by feeding ds Se Cad1b, of newly hatched larvae of Spodoptera exigua. The results showed that after feeding ds Se Cad1b for 24 hours, the expression of cadherin gene decreased significantly, and the sensitivity to Cry1Ac,Cry2Aa protein decreased and mortality decreased significantly after silencing the cadherin gene. The expression and purification of cadherin polypeptide fragment Se Cad1b,Se CR7-8F,Se CR9-MPED were combined with biotin labeled Cry1Ac,Cry2Aa, and it was found that all three segments of peptides could bind to two proteins specifically. 3. After purification, homologous competitive and heterogenous competitive dot hybridization of cadherin polypeptide Se Cad1b,Se CR7-8F,Se CR9-MPED with Cry1Ac and Cry2Aa were performed respectively. In homologous competition, the two Cry proteins were competitively bound on the three polypeptide fragments, but not on the polypeptide fragments in the heterologous competition. In conclusion, the receptor function of Se Cad1b gene as Cry1Ac and Cry2Aa protein in Spodoptera exigua was confirmed, and Cry1Ac and Cry2Aa had different binding sites on Se Cad1b protein of Spodoptera exigua. This study laid a theoretical foundation for the study of resistance mechanism of Spodoptera exigua to Cry protein and was of great significance to the development of bivalent transgenic crops.
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S433.4

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本文編號：2246675