本文關(guān)鍵詞： 伯克氏菌 葡萄座腔菌 DNA條形碼 檢測 鑒定　出處：《中國農(nóng)業(yè)大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：DNA條形碼技術(shù)是一種物種快速鑒定的方法,受到廣泛關(guān)注,能夠彌補傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)鑒定的不足,推動生物多樣性研究的發(fā)展。伯克氏菌屬(Burkholderia)屬于變形菌門(Proteobacteria)是一類重要的革蘭氏陰性細(xì)菌,報道超過60個種,廣泛存在于土壤、空氣及水體等環(huán)境中,部分種是動物或者植物重要的病原菌,其中包括B. gladioli pv. alliicola等在內(nèi)的至少3種被列入中國進境檢疫性有害生物名錄。葡萄座腔菌屬(Botryosphaeria)及其相關(guān)的無性世代所在的屬分類復(fù)雜,可以用于分類的形態(tài)學(xué)特征較少且不穩(wěn)定,難以通過形態(tài)學(xué)對其進行準(zhǔn)確鑒定�；谝陨媳尘�,本研究以伯克氏菌屬和葡萄座腔菌屬為對象,開展了DNA條形碼篩選及分子檢測相關(guān)研究,主要結(jié)果如下：(1)伯克氏菌屬DNA條形碼研究:以伯克氏菌屬29個種87株菌為材料進行了DNA條形碼研究。以16S rRNA、gyrB、rpoD和lepA為候選基因,通過遺傳距離分析、系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建和’TaxonDNA鑒定效果等方法對這4個候選基因進行了評價,結(jié)果表明16S rRNA基因種內(nèi)和種間變異較小,gyrB基因種內(nèi)差異最大,rpoD基因種問差異最大�；谙到y(tǒng)發(fā)育樹和’[axonDNA法鑒定成功率結(jié)果表明,lepA基因的鑒定成功率最高,可以作為伯克氏菌屬DNA條形碼,但是對于洋蔥伯克氏菌復(fù)合種的鑒定能力需要進一步進行驗證。以伯克氏菌屬lepA基因為研究對象,比較DNA條形碼方法,遺傳距離法,基于距離的分析方法(ABGD法),基于聚類的方法(單系法)和基于特征的方法(BLOG法)。結(jié)果表明,特征法的對于75株菌的鑒定成功率為100%,高于其他三種方法,對于洋蔥伯克氏菌復(fù)合種也能夠有效的進行鑒定。(2)洋蔥腐爛伯克氏菌的LAMP檢測;針對洋蔥腐爛病菌(.B. gladioli pv. alliicola) ITS序列設(shè)計了4條LAMP引物,通過優(yōu)化反應(yīng)溫度,建立了實時LAMP及可視化LAMP檢測方法。該方法特異性好,僅對Bga菌株檢測呈陽性,對于與Bga同屬不同種或同種不同致病型菌株,檢測結(jié)果均為陰性。檢測靈敏度達(dá)到1fg/μL的基因組DNA,比普通PCR靈敏度高100倍,能夠用于洋蔥腐爛病菌的快速檢測。(3)葡萄座腔菌屬DNA條形碼研究：以ITS、LSU、TUB和EF-la為候選DNA條形碼,利用遺傳距離分析、系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建、TaxonDNA法和特征法對4個候選基因進行綜合評價,結(jié)果表明,LSU基因種內(nèi)和種間變異較小,EF-1α基因種內(nèi)和種間差異最大�；凇甌axonDNA法和特征值法鑒定結(jié)果表明,EF-1α基因的鑒定成功率最高,可以作為葡萄座腔菌屬及其相關(guān)菌株的DNA條形碼。(4)引起蘋果腐爛病菌的三種葡萄座腔菌的實時熒光PCR檢測：通過設(shè)計三組引物和探針,建立了快速檢測三種蘋果腐爛病菌B. dothidea, B. obtusa和B. stevensii的實時熒光PCR檢測方法,檢測靈敏度分別為10-3 ng/μL、10-3 ng/μL、10-4ng/μL�；趩我话袠�(biāo)的實時熒光,進一步構(gòu)建了多重實時熒光PCR檢測方法,檢測靈敏度為10-3 ng/μL,能夠?qū)崿F(xiàn)同時對三種病原真菌的檢測。
[Abstract]:DNA barcode technology is a rapid identification method of species, which has attracted wide attention and can make up for the shortcomings of traditional morphological identification. Burkholderiabelonging to Proteobacteria, an important class of Gram-negative bacteria, has been reported for more than 60 species in soil, air and water environments. Some species are important pathogens of animals or plants, and at least three of them, including B. gladioli PV. Alliicola and others, are included in the list of quarantine pests in China. The taxonomy of the genus Botryosphaeria and its related asexual generations is complex. The morphological characteristics that can be used for classification are less and unstable, so it is difficult to identify them accurately by morphology. Studies on DNA barcode screening and molecular detection were carried out. The main results were as follows: (1) DNA barcode study was carried out. DNA barcode was studied with 87 strains of 29 species of Burke's genus. 16s rRNAs gyrBrpoD and lepA were used as candidate genes. The four candidate genes were evaluated by genetic distance analysis, phylogenetic tree construction and Taxon DNA identification. The results showed that the variation of 16s rRNA gene within species and between species was the greatest. Based on phylogenetic tree and'[axonDNA] method, the results showed that the success rate of identification of rRNA A gene was the highest. It can be used as DNA bar code, but the identification ability of Burke's bacteria complex species needs further verification. Taking lepA gene of Burke's bacillus as the research object, the method of DNA bar code and genetic distance method are compared. Distance based analysis methods include ABGD method, clustering method (single line method) and feature based method (blog). The results show that the success rate of characteristic method for 75 strains of bacteria is 100, which is higher than that of the other three methods. The complex species of Burkella cepacia could also be effectively identified by LAMP, and four LAMP primers were designed for the ITS sequence of B. gladioli pv.alliicola, and the reaction temperature was optimized by optimizing the reaction temperature. A real-time LAMP and visual LAMP detection method was established. The method was specific and positive only for Bga strains, and was different from the same species or the same pathotypes as Bga. The genomic DNA with a sensitivity of 1 fg / 渭 L was 100 times higher than that of the common PCR, and could be used for the rapid detection of the onion rot bacteria. DNA bar code was used for the study of the genus DNA: ITSLSUTUB and EF-la were used as candidate DNA bar codes. Using genetic distance analysis, phylogenetic tree construction Taxon DNA method and characteristic method were used to evaluate the four candidate genes. The results showed that the variation of LSU gene within species and between species was the greatest, and the result of Taxon DNA and eigenvalue method showed that the success rate of identification of EF-1 偽 gene was the highest. It can be used as the DNA bar code of the genus Vitis and its related strains. It can be used to detect three kinds of rotting bacteria of apple by real-time fluorescence PCR: by designing three sets of primers and probes, A real-time fluorescence PCR method for rapid detection of three kinds of apple rot bacteria B.dothidea, B. obtusa and B. stevensii was established. The detection sensitivity was 10-3 ng / 渭 L ~ (10 ~ (-3)) ng / 渭 L ~ (10 ~ (-4)) ng / 渭 L. based on a single target, a multiplex real-time fluorescence PCR detection method was further constructed. The detection sensitivity was 10-3 ng / 渭 L, which could be used to detect three pathogenic fungi simultaneously.
【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S432.4

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本文編號：1530905