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轉(zhuǎn)基因大豆、玉米、水稻深加工產(chǎn)品的五重巢式PCR技術(shù)檢測(cè)

轉(zhuǎn)基因大豆、玉米、 轉(zhuǎn)基因大豆、玉米、水稻深加工產(chǎn)品的五重巢式 PCR 技術(shù)檢測(cè)

近年主要轉(zhuǎn)基因糧食作物大豆、玉米和水稻加工產(chǎn)品已應(yīng)用于食品制造業(yè)，為此，食品中轉(zhuǎn)基因成 分的安全性受到廣泛關(guān)注。當(dāng)前，國(guó)際貿(mào)易和各國(guó)食品工業(yè)等部門對(duì)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品逐步實(shí)施 IP(Identity Preservation)管理，加強(qiáng)檢測(cè)監(jiān)控。 深加工品經(jīng)過(guò)若干道加工程序，理化性質(zhì)變

化、 DNA 斷裂，轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè)的難度大大增加。目 前，國(guó)際上沒(méi)有統(tǒng)一的針對(duì)轉(zhuǎn)基因糧食作物深加工產(chǎn)品的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，而我國(guó)也沒(méi)有建立有效的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn) 對(duì)市場(chǎng)上常見(jiàn)的轉(zhuǎn)基因大豆、玉米和水稻深加工產(chǎn)品中的主要外源 CrylA (B)、BAR、CP4 EPSPS 和 PAT 基因進(jìn)行檢測(cè)。 五重巢式 PCR 是近幾年出現(xiàn)的檢測(cè)技術(shù)， 它結(jié)合了巢式 PCR 的高靈敏度和多重 PCR 的快速、 簡(jiǎn)單 和高特異性特點(diǎn)，可以減少假陽(yáng)性，可以同時(shí)檢測(cè)多個(gè)基因片段，可以使檢測(cè)靈敏度的下限提高幾千倍 ‘3]。五重巢式 PCR 方法快速、靈敏度高，在人和動(dòng)物疾病檢測(cè)和病毒鑒定中應(yīng)用較多。目前該技術(shù)在 轉(zhuǎn)基因檢測(cè)中的應(yīng)用還較少，僅在轉(zhuǎn)基因大豆深加工制品和轉(zhuǎn)基因水稻種子的檢測(cè)中有半巢式 PCR 應(yīng) 用的報(bào)道。但這些技術(shù)僅能對(duì)轉(zhuǎn)基因大豆或水稻單一品種進(jìn)行檢測(cè)，在做不同品種或品系轉(zhuǎn)基因成分檢 測(cè)時(shí)，需要分別試驗(yàn)，比較繁瑣。迄今為止，還沒(méi)有快速、高通量同時(shí)檢測(cè)不同品種和不同品系的轉(zhuǎn)基 因大豆、玉米和水稻外源基因的報(bào)道。本研究旨在建立五重巢式 PCR 體系，探索糧食深加工產(chǎn)品中的轉(zhuǎn) 基因成分，實(shí)現(xiàn)不同品種和不同品系糧食作物轉(zhuǎn)基因成分的高通量檢測(cè)，為轉(zhuǎn)基因深加工產(chǎn)品檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn) 的建立提供理論基礎(chǔ)。 1 材料與方法 1.1 材料 1.1.1 試驗(yàn)材料 轉(zhuǎn)基因 RR 大豆購(gòu)自美國(guó)孟山都公司；轉(zhuǎn)基因玉米 Bt11、Bt176 由吉林農(nóng)科院惠贈(zèng)；轉(zhuǎn)基因水稻 由農(nóng)業(yè)部轉(zhuǎn)基因生物安全管理辦公室提供；轉(zhuǎn)基因玉米 MON810、TC1507、T25 和 CBH-351 購(gòu)自 香港基因芯片公司，作為陽(yáng)性對(duì)照。非轉(zhuǎn)基因大豆、玉米和水稻由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院提供，作為陰性 對(duì)照。待檢深加工產(chǎn)品大豆蛋白質(zhì)粉、巧克力飲品、嬰兒米粉、大豆卵磷脂、大豆油、大豆色拉油、玉 米油、玉米淀粉、玉米蛋白粉、營(yíng)養(yǎng)麥片（含有稻米成分）和玉米泥均購(gòu)自超市，均未注明是否含有轉(zhuǎn) 基因成分。 1.1.2 試驗(yàn)試劑 Wizard@試劑盒，Promega 公司(Madison， USA)；Taq DNA 聚合酶、dNTP、10×PCR 緩沖 液（含 MgC12）、DL DNA2000 分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，大連寶生物工程有限公司；特異引物，上海英俊生物 公司。 1.1.3 儀器設(shè)備 高速離心機(jī)（上海安亭公司，TDL-40B 型）、 PCR 儀（德國(guó) Biometra，Biometra Tgradient 型）、核酸電泳儀（杭州托普儀器有限公司，GE-100 型）、紫外分光光度儀（美國(guó) BECKMAN，DU@ 640 型）、凝膠成像系統(tǒng)（美國(guó) UVP，G8000 型）。 1.2 方法 1.2.1 DNA 提取 將轉(zhuǎn)基因大豆、玉米、水稻和非轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)基因大豆、玉米、水稻分別按不同質(zhì)量比混合成標(biāo)準(zhǔn)品， 取標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)樣品（按操作說(shuō)明要求的質(zhì)量）分別根據(jù) Wizard@試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行 DNA 提取，并

用紫外分光光度計(jì)將 DNA 溶液稀釋至同一質(zhì)量濃度(50 ng/uL)。 1.2.2 引物設(shè)計(jì) 利用 Primer Premier V5.0 軟件進(jìn)行五重巢式 PCR 的引物設(shè)計(jì)，用 Oligo V6.22 軟件篩選出引 物之間互相干擾最小的引物，引物所擴(kuò)增目的片段及擴(kuò)增產(chǎn)物大小見(jiàn)表 1。 1.2.3 五重巢式 PCR 反應(yīng)體系 1)第 1 輪五重 PCR 反應(yīng)體系及反應(yīng)條件。 在第 1 輪五重 PCR 反應(yīng)體系中， DNA 模板 1uL(50 ng)，， 加 dNTP 各 0.4 mmol/L， 2×PCR 緩沖液， 引物混合液工 （CP4 WF/ CP4 WR， 0.8umol/L;Rbcl WF/Rbcl WR,0.3 umol/L;CryWF/Cry WR,0.25 umol/L;BAR WF/BAR WR,0.4umol/L; Pat WF/Pat WR， 0.4 ptmol/L;)10 uL，DNA 聚合酶 4 U，補(bǔ)去離子水至 50 uL。 擴(kuò)增條件為：95℃預(yù)變性 10 min; 95℃30 s，65℃60 s，72℃60 s，10 個(gè)循環(huán)；95℃30 s， 62℃60 s，72℃60 s，10 個(gè)循環(huán)；95℃30 s，60℃60 s，72℃60 s，10 個(gè)循環(huán)；95℃30 s，58℃ 60 s，72℃60 s，10 個(gè)循環(huán)：72℃，10 min。 2)第 2 輪五重 PCR 反應(yīng)體系及反應(yīng)條件。取第 1 輪五重 PCR 產(chǎn)物 1_uL 作為模板，進(jìn)行五重巢式 PCR 第 2 輪擴(kuò)增。 反應(yīng)體系中加引物混合液Ⅱ(CP4 NF/ CP4 NR,0.6umol/L; Rbcl NF/Rbcl NR,0. 25 umol/L; CryNF/Cry NR,0.5umol/L; BAR NF/BAR NR,0.3 umol/L;Pat NF/Pat NR,0.6 umol/L;)10 uL，DNA 聚合酶 4U，其余步驟同前。 擴(kuò)增條件同上。 3)檢測(cè)方法的靈敏度分析。將轉(zhuǎn)基因大豆、玉米、水稻和非轉(zhuǎn)基因大豆、玉米、水稻分別按不同質(zhì) 量比混合， 使樣品轉(zhuǎn)基因成分的含量分別達(dá)到 5%、 1%、 5×10-1%、 5×10_2%、 5×10_3%、 10-3%、 5×10_4%和 10-4%。用上述 PCR 方法對(duì)含混合 DNA 樣品進(jìn)行靈敏度測(cè)試。 4)擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)。 兩輪多重 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物用瓊脂糖電泳檢測(cè)，瓊脂糖膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 3%，膠中溴化乙錠質(zhì)量濃度為 0.5ug/mL，電泳緩沖液為 1× TAE，以 DL-2000 DNA 做分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，電泳條件為 10 V/cm 電壓， 電泳 lh。 2 結(jié)果與分析 2.1 DNA 提取 本研究所選材料均是深加工制品，測(cè)量所提取 DNA 樣品的 OD260 值小于 0.1 以及 OD260/OD280 也小于 1.5，進(jìn)行電泳檢測(cè)時(shí)也觀察不到 DNA 條帶（圖 1），說(shuō)明所提取 DNA 樣品 濃度很低。 用普通 PCR 擴(kuò)增是檢測(cè)不出結(jié)果的， 但用隨后的五重巢式 PCR 進(jìn)行擴(kuò)增卻可以檢測(cè)到清楚 的目的帶，說(shuō)明使用 Wizard@試劑盒提取的 DNA 可以滿足五重巢式 PCR 擴(kuò)增的需要。 2.2 五重巢式 PCR 樣品檢測(cè) 第 1 輪擴(kuò)增結(jié)果見(jiàn)圖 2(a)，該體系擴(kuò)增出陽(yáng)性對(duì)照的 CP4-EPSPS 基因、RBCL 基因、CrylA (B) 基因、 BAR 基因和 PAT 基因， 擴(kuò)增片段大小分別為 498、 433、 321、 201 和 160 bp 及陰性對(duì)照的 RBCL 基因。陽(yáng)性對(duì)照結(jié)果說(shuō)明擴(kuò)增體系正常，可以擴(kuò)增出目的基因；陰性對(duì)照結(jié)果表明實(shí)驗(yàn)過(guò)程中無(wú)假陽(yáng)性 結(jié)果，排除轉(zhuǎn)基因成分污染的可能；空白對(duì)照無(wú)擴(kuò)增條帶說(shuō)明無(wú)污染。但其他泳道未看到擴(kuò)增結(jié)果，表 明深加工制品中 DNA 含量非常低，普通的 PCR 反應(yīng)無(wú)法進(jìn)行轉(zhuǎn)基因檢測(cè)。 第 2 輪擴(kuò)增結(jié)果(圖 2(b))顯示，卵磷脂、大豆蛋白質(zhì)粉、巧克力飲品、嬰兒米粉擴(kuò)增出 RBCL 基 因和 CP4-EPSPS 基因片段，即以上 4 種樣品含有轉(zhuǎn) CP4-EPSPS 基因成分；玉米淀粉和玉米泥中擴(kuò)增 出 RBCL 基因、CrylA (B)基因和 PAT 基因片段，即以上 2 種樣品含有轉(zhuǎn) CrylA (B)基因和 PAT 基因 成分； 玉米蛋白粉擴(kuò)增出 RBCL 基因、 CrylA(B)基因和 BAR 基因片段， 即含有轉(zhuǎn) CrSA (B)基因和 BAR 基因成分；營(yíng)養(yǎng)麥片擴(kuò)增出 RBCL 基因和 CrylA (B)基因片段，即含有轉(zhuǎn) CrylA (B)基因成分；大豆精 煉油大豆色拉油和玉米油未檢出任何條帶，即未從這 3 種樣品中提取出 DNA。表明經(jīng)過(guò)第 2 輪的巢式

PCR 擴(kuò)增，可以檢測(cè)出除精煉油外的深加工制品的轉(zhuǎn)基因成分。 2.3 五重巢式 PCR 靈敏度分析 在第 1 輪五重 PCR 靈敏度分析實(shí)驗(yàn)中，5× lO_1%的陽(yáng)性混合標(biāo)準(zhǔn)品中利用 5 對(duì)外引物能夠同時(shí) 擴(kuò)增出 5 個(gè)目的基因片段，在 5×10-2G 的陽(yáng)性 t 昆合標(biāo)準(zhǔn)品中只能擴(kuò)增出 RBCL 基因、CrylA (B)和 PAT 基因，說(shuō)明第 1 輪五重 PCR 的靈敏度為 0.5%（圖 3）。 在第 2 輪五重 PCR 靈敏度分析實(shí)驗(yàn)中，5×10-3%的陽(yáng)樣性混合標(biāo)準(zhǔn)品中能夠同時(shí)擴(kuò)增出較為清 晰的 5 個(gè)目的基因，1×10-3%的陽(yáng)性混合標(biāo)準(zhǔn)品 中只能擴(kuò)增出 RBCL 基因、CP4-EPSPS 基因和 CrylA (B)基因，5×10_ 40 的陽(yáng)性混合標(biāo)準(zhǔn)品中 只能擴(kuò)增出 RBCL 基因和 CrylA (B)基因，說(shuō)明五重巢式 PCR 的靈敏度為 5×10_3%（圖 4）。 3 結(jié)論與討論 1)本試驗(yàn)針對(duì)轉(zhuǎn)基因市場(chǎng)上常見(jiàn)的轉(zhuǎn)基因糧食作物大豆、玉米和水稻的主要外源 CrylA (B)基因、 BAR 基因、CP4EPSPS 基因、PAT 基因及共同的內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因 RBCL 基因的特點(diǎn)設(shè)計(jì)了 10 對(duì)引物，建 立了五重巢式 PCR 體系，其檢測(cè)靈敏度達(dá)到 0.005%，對(duì) 11 個(gè)大豆、玉米和水稻深加工制品進(jìn)行了 五重巢式 PCR 檢測(cè)， 檢測(cè)出除大豆精煉油、 色拉油和玉米油以外的所有深加工產(chǎn)品的主要外源 CrylA(B) 基因、BAR 基因、CP4-EPSPS 基因、 PAT 基因及共同的內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因 RBCL 基因，結(jié)果表明本研究建 立的五重巢式 PCR 檢測(cè)方法適用于主要轉(zhuǎn)基因糧食作物深加工產(chǎn)品的定性檢測(cè)。 深加工轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品中 DNA 提取需要大量的樣品材料才能得到足夠的 DNA 進(jìn)行分析。 由于深加工食 品中 DNA 模板含量少，需要利用高效的或特殊的 DNA 提取方法，以提取到其中微量的 DNA。使用普 通的 DNA 和其他試劑盒進(jìn)行 DNA 提取， 不能擴(kuò)增得到 PCR 產(chǎn)物， 說(shuō)明 DNA 提取失敗。 利用 Wizard@ 試劑盒，可有效提取到所選 11 種樣品中 8 種樣品的 DNA 模板。實(shí)驗(yàn)表明，豆油和玉米油中的 DNA 在 產(chǎn)品制備過(guò)程中已遭到極為嚴(yán)重的破壞和降解并且含量極低，對(duì)豆油和玉米油已無(wú)轉(zhuǎn)基因檢測(cè)的必要， 而其他深加工產(chǎn)品均可使用此試劑盒進(jìn)行 DNA 模板提取。 外源基因在轉(zhuǎn)入植物中時(shí)，作了不同程度的修飾和改造，導(dǎo)致不同品種、品系的轉(zhuǎn)基因植物中相同 基因的 DNA 序列有很大差異。如 CrylA (B)基因在抗蟲水稻和抗蟲玉米中就不相同，并且在玉米的不 同品系如 BTll、BT176 和 MON810 中也不相同，這樣就給檢測(cè)這些基因造成了很大麻煩，對(duì)于不同品 種甚至不同品系轉(zhuǎn)基因植物的檢測(cè)都需要設(shè)計(jì)不同的引物進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增。 本試驗(yàn)對(duì)同一目的基因在不同 品種和不同品系中的序列進(jìn)行分析，在保守區(qū)域設(shè)計(jì)多對(duì)引物，篩選出了可以在不同品種和不同品系中 通用的引物進(jìn)行檢測(cè)， 所設(shè)計(jì)的 CrylA(B)基因引物可以同時(shí)擴(kuò)增轉(zhuǎn)基因玉米 BT11、 BT176、 MON810 和轉(zhuǎn)基因水稻中的 CrylA(B)基因；PAT 基因引物可以同時(shí)擴(kuò)增轉(zhuǎn)基因玉米 BT11、T25 和 TC1507 中 的 PAT 基因；BAR 基因引物可以同時(shí)擴(kuò)增轉(zhuǎn)基因玉米 BT176 和 CBH351 中的 BAR 基因，大大提高 了檢測(cè)效率。 2)此外，本研究將大豆、玉米和水稻中共同的內(nèi)參照基因 RBCL 基因也同時(shí)放到 PCR 體系中進(jìn)行 擴(kuò)增。 內(nèi)對(duì)照的設(shè)置對(duì)于植物轉(zhuǎn)基因成分 PCR 檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性來(lái)說(shuō)是非常重要的。 以植物體中肯定含 有的基因成分為內(nèi)參照對(duì)其進(jìn)行擴(kuò)增，如果內(nèi)參照基因擴(kuò)增成功，則表明模板 DNA 質(zhì)量、數(shù)量符合檢 測(cè)需要。如果內(nèi)參照基因擴(kuò)增失敗，則表明擴(kuò)增體系中含有抑制成分，需對(duì)模板質(zhì)量、數(shù)量進(jìn)行優(yōu)化以 消除抑制因子。顯然，內(nèi)參照的設(shè)立是衡量模板 DNA 質(zhì)量，從而排除由模板中雜質(zhì)造成的假陰性結(jié)果 的一個(gè)有力措施。 自從權(quán)潔霞對(duì) 23 種植物進(jìn)行分析， 找到了轉(zhuǎn)基因植物檢測(cè)通用的內(nèi)源參照基因-RBCL 基因后， RBCL 基因作為內(nèi)源參照基因廣泛應(yīng)用于番木瓜、 番茄、 水稻和草莓的轉(zhuǎn)基因檢測(cè)中， 表明 RBCL 基因可以作為植物內(nèi)源參照基因進(jìn)行轉(zhuǎn)基因檢測(cè)，改變了現(xiàn)行的“一種植物一種檢測(cè)內(nèi)對(duì)照”的情況，大 大提高了檢測(cè)效率， 降低了檢測(cè)成本。 本研究中也對(duì) RBCL 基因在大豆、 玉米和水稻的擴(kuò)增進(jìn)行了分析， 發(fā)現(xiàn) RBCL 基因在大豆、玉米和水稻中都得到穩(wěn)定擴(kuò)增。因此，本試驗(yàn)選用了大豆、玉米和水稻中通用 的內(nèi)參照基因 RBCL 基因，不但可有效地防止假陰性結(jié)果的出現(xiàn)，而且還可以提高檢測(cè)效率、縮短檢測(cè)

周期。 在五重巢式 PCR 體系的建立中，影響復(fù)合 PCR 反應(yīng)的因素很多，其中最重要的是引物濃度。通常 根據(jù)擴(kuò)增條帶質(zhì)量調(diào)整不同引物的濃度，降低過(guò)亮條帶的引物濃度，增加條帶過(guò)暗的引物濃度，直至最 佳擴(kuò)增結(jié)果。有研究表明，擴(kuò)增片段較大的，所用引物濃度應(yīng)該大一些，而擴(kuò)增片段小的引物濃度可以 相對(duì)小一些，有時(shí)幾乎成正比例。而本研究結(jié)果與上述有所差別，因此，各種引物擴(kuò)增所需的濃度并沒(méi) 有統(tǒng)一的規(guī)定，必須通過(guò)實(shí)驗(yàn)反復(fù)驗(yàn)證才能確定。 3)擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度也是深加工制品轉(zhuǎn)基因檢測(cè)過(guò)程中的至關(guān)重要的因素，由于技術(shù)處理使得 DNA 斷裂或降解，從而導(dǎo)致假陰性結(jié)果。因此，在設(shè)計(jì)引物時(shí)盡量將擴(kuò)增片段大小控制在較小范圍內(nèi)，避免 擴(kuò)增片段大導(dǎo)致假陰性結(jié)果和擴(kuò)增片段小降低反應(yīng)特異性的缺點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的內(nèi)、外兩組特異性引物 （每組 5 對(duì)引物），擴(kuò)增片段大小都在 100～500 bp，保證試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，避免假陰性結(jié)果的出 現(xiàn)，同時(shí)設(shè)立空白對(duì)照、陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照可有效排除假陽(yáng)性和假陰性結(jié)果。 4)五重巢式 PCR 檢測(cè)體系最終靈敏度應(yīng)以第二輪五重 PCR 反應(yīng)的靈敏度(0.005%)為準(zhǔn)，即五重 巢式 PCR 檢測(cè)體系可檢出轉(zhuǎn) CP4-EPSPS 基因、CrylA(B)基因、 BAR 基因和 PAT 基因的量達(dá) 0． 005% 以上的樣品。此檢測(cè)體系靈敏度稍高于 Zimmermann 等人用巢式 PCR 方法對(duì)轉(zhuǎn)基因玉米進(jìn)行檢測(cè)所 得靈敏度(0.01%)； 而遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于利用多重 PCR 方法進(jìn)行轉(zhuǎn)基因檢測(cè)的靈敏度， Roberta 等應(yīng)用五重巢 式 PCR 對(duì) Alphaviruse 病毒進(jìn)行檢測(cè)和鑒定，將靈敏度提高 1 000 倍；而本試驗(yàn)將靈敏度提高 100 倍，這可能是多重 PCR 中各引物之間的干擾使擴(kuò)增效率下降導(dǎo)致的，但 o．005%的靈敏度已經(jīng)能夠滿 足深加工產(chǎn)品檢測(cè)需要。試驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，本五重巢式 PCR 的靈敏度已經(jīng)達(dá)到國(guó)際領(lǐng)先水平，完全適用于 大豆、玉米和水稻深加工產(chǎn)品的檢測(cè)，并且可以將此技術(shù)試用于其他產(chǎn)品或其他研究領(lǐng)域。



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