本文關(guān)鍵詞：載BMP-2基因PLGA微球的制備及在體內(nèi)外成骨作用的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

《吉林大學(xué)》 2013年

載BMP-2基因PLGA微球的制備及在體內(nèi)外成骨作用的研究

喬春燕  

【摘要】：各種原因引起的牙槽骨吸收萎縮是口腔醫(yī)學(xué)領(lǐng)域最常見的臨床表現(xiàn)之一，不僅影響顏面美觀，咀嚼、發(fā)音和進食功能以及后續(xù)的義齒修復(fù)，還嚴重影響患者的身心健康。目前存在的治療牙槽骨吸收和萎縮的方法有：自體或異體骨移植、骨替代物移植、干細胞組織工程骨以及應(yīng)用牽張成骨技術(shù)等。但是因為自體骨來源有限，異體骨移植可引起免疫排斥反應(yīng)和其他疾病的風(fēng)險；骨替代物移植和干細胞組織工程骨成骨能力有限；牽張成骨技術(shù)價格昂貴、技術(shù)復(fù)雜等問題，因此希望尋找一種安全、有效、簡便、易行的方法來治療牙槽骨的吸收萎縮。 目前，應(yīng)用骨形成蛋白（BMP）促進萎縮的牙槽骨成骨能力已經(jīng)取得了一定的進展，，但是由于體內(nèi)應(yīng)用其半衰期短、需要應(yīng)用毫克量甚至更多量才能實現(xiàn)其促進骨形成的作用，致使價格昂貴。轉(zhuǎn)基因治療骨再生是借助轉(zhuǎn)基因技術(shù)，利用外源基因在自體細胞內(nèi)表達并分泌骨形成蛋白達到治療骨破壞性疾病的目的。研究表明，通過轉(zhuǎn)染骨折部位的細胞，使其分泌內(nèi)源性BMP促進骨再生效果要好于直接應(yīng)用外源性重組蛋白。因此，轉(zhuǎn)基因治療促進骨形成將是一種趨勢并在臨床治療中發(fā)揮重要作用。 傳統(tǒng)的給藥方式是利用病毒載體通過注射給藥，缺陷是存在生物安全隱患，并且需要多次用藥，造成患者的順從性差。因此，研制具有緩釋、控釋效果的載基因體系非常必要。微球的優(yōu)點在于其比表面積大具有較強的藥物攜帶能力；此外其可塑性強，對缺損形狀要求低，通常不需要進行外科手術(shù)。PLGA是PLA和PGA的共聚物，是一種生物可降解性高分子材料，無毒、無免疫原性，具有良好的生物相容性，其降解速度能夠通過改變PLA和PGA的比例來改變，常被作為運輸藥物或者基因的載體材料。 基于以上背景，本研究擬以PLGA為載體材料，包覆BMP-2基因(pBMP-2)，通過高分子化學(xué)技術(shù)，制備載BMP基因的微球；進一步采用細胞生物學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)體內(nèi)和體外研究經(jīng)PLGA包封后的BMP-2基因體內(nèi)外對成骨作用的影響，并闡述其機制。具體研究內(nèi)容包括： 一、載BMP-2基因PLGA微球的制備與表征 首先，采用復(fù)乳溶劑蒸發(fā)法（W/O/W）制備載基因PLGA微球，結(jié)果顯示：采用優(yōu)化的參數(shù)組合制備的載基因微球粒徑為3-15微米，載藥率1.7±0.5%，包封率為40.3±7.3%，24h釋放率為7.5±0.37%,隨后呈持續(xù)緩慢釋放，45天時達到79%±3.95%。結(jié)果表明，通過復(fù)乳溶劑蒸發(fā)法制備的PLGA微球可以作為BMP的緩釋載體。 二、載CaPi/DNA復(fù)合物PLGA微球的表征及在體內(nèi)異位成骨的研究 通過上述優(yōu)化方案制備載磷酸鈣/基因（CaPi/DNA）復(fù)合物PLGA微球(PLGA@CaPi/DNA)。TEM結(jié)果顯示微球內(nèi)有大量的晶體樣物，證明CaPi/EGFP被成功包封在微球內(nèi)部；熒光顯微鏡下觀察到經(jīng)轉(zhuǎn)染后的MC3T3-E1細胞，部分呈現(xiàn)綠色，證明包裹在PLGA微球內(nèi)的EGFP基因可以保持其生物活性；軟X線和組織學(xué)分析表明載BMP-2基因微球植入大鼠股部肌囊8周時，材料周圍有新骨形成。以上結(jié)果表明：通過復(fù)乳溶劑蒸發(fā)法制備的PLGA微球可以作為BMP基因的緩釋載體，促進新骨形成。 三、載PEI/pBMP-2復(fù)合物PLGA微球的制備與表征 熒光顯微鏡觀察載PEI/pBMP-2/FITC PLGA微球(PLGA@PEI/pBMP-2/FITC)顯示綠色，與細胞共培養(yǎng)1天，僅有非常少的細胞內(nèi)有熒光，共培養(yǎng)3天，少量細胞內(nèi)有熒光，共培養(yǎng)7天發(fā)現(xiàn)超過50%的細胞內(nèi)出現(xiàn)熒光,共培養(yǎng)3天后裂解細胞進行PCR反應(yīng)可成功擴增出BMP-2cDNA。表明載基因復(fù)合物的PLGA微球具有降解和控制釋放基因等功能。 四、PLGA@PEI/pBMP-2復(fù)合物微球在體內(nèi)外成骨作用的研究 將載PEI/pBMP-2PLGA微球(PLGA@PEI/pBMP-2)和MC3T3細胞共培養(yǎng)， Realtime檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)成骨相關(guān)因子的表達在共培養(yǎng)1天實驗組和對照組無明顯差別，3天開始出現(xiàn)差別但是差異不顯著，7天、14天實驗組和對照組出現(xiàn)明顯差別并具有統(tǒng)計學(xué)意義；茜素紅結(jié)果顯示，共培養(yǎng)14天實驗組鈣結(jié)節(jié)形成量明顯多于對照組；Elisa結(jié)果顯示，共培養(yǎng)3天后即可觀察到人BMP-2的分泌，到14天逐漸增多。Micro CT結(jié)果顯示實驗組缺損周圍不規(guī)則，缺損內(nèi)部有高密度影，對照組缺損周圍較為光滑，缺損內(nèi)部依然空白，HE染色顯示實驗組缺損邊緣有較多編織狀骨，缺損中心同樣有編織狀骨形成，而對照組缺損全部有纖維結(jié)締組織修復(fù)。 以上實驗結(jié)果表明：采用復(fù)乳溶劑蒸發(fā)法制備的載BMP-2基因PLGA微球能夠緩慢持續(xù)釋放BMP-2基因，進一步轉(zhuǎn)染有關(guān)細胞在骨缺損部位促進骨形成。這種材料具有良好的生物相容性，在將來促進骨形成的研究中將是一種具有很好應(yīng)用前景的骨缺損修復(fù)材料。

【關(guān)鍵詞】：
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R781.05
【目錄】：

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本文編號：79206