本文關鍵詞：應用表達譜芯片和熒光素酶報告系統(tǒng)篩選并鑒定大腸癌FOXQ1基因的潛在下游靶基因

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【摘要】：第一部分利用基因芯片探究FOXQ1在結腸癌中的作用目的：探究人結腸癌細胞DLD1在敲低FOXQ1基因前后m RNA和microRNA的表達改變。方法：提取DLD1-shFOXQ1 和 DLD1-shControl兩組細胞的RNA,分別與Whole Human Genome Oligo Microarray (4×44 K, Agilent Technologies)全基因組表達譜芯片和miRCURYTM LNA Array (v.18.0, Agilent Technologies) MicroRNA芯片進行雜交,應用GeneSpring、Genepix軟件對芯片結果進行統(tǒng)計,對全基因組表達譜芯片進行GO、Pathway分析,對全基因組表達譜芯片和microRNA芯片結果進行關聯(lián)分析,并應用qRT-PCR對部分結果進行驗證。應用Microsoft Excel 和 SPSS17.0軟件進行統(tǒng)計學分析。結果：全基因組表達譜的檢測結果表明,敲低FOXQ1基因后,在芯片所涵蓋的41093個基因中,以|FC|≥2作為具有顯著性差異標準,共有255個基因上調,176個基因下調。QRT-PCR的驗證結果與全基因組表達譜芯片的結果基本相符。MicroRNA芯片的檢測結果表明,經敲低FOXQ1基因后,以|FC|≥2作為具有顯著性差異標準,共有31個microRNA上調,12個microRNA下調。表明FOXQ1在結腸癌的發(fā)生和發(fā)展過程中,與細胞因子-細胞因子受體等途徑存在密切關系。同時發(fā)現(xiàn)在結腸癌細胞系DLD1中,microRNA-208b-3p、microRNA-320d可能作為FOXQ1的上游,負向調控了FOXQ1的表達。結論：本研究了解了FOXQ1基因敲低前后mRNA和MicroRNA的表達改變,為后續(xù)FOXQ1在結腸癌的發(fā)生發(fā)展中的作用機制研究提供了重要的線索和實驗依據(jù)。第二部分利用雙熒光素酶報告系統(tǒng)探究FOXQ1在結腸癌中直接轉錄激活的靶基因目的：檢測人結腸癌細胞DLD1中,FOXQ1直接轉錄激活的靶基因。方法：利用信息生物學JASPAR等工具進行FOXQ1靶位點的預測,構建含HBEGF、PDGFβ、PDGFRβ、PLAT、IL1β5個基因啟動子區(qū)域的螢火蟲熒光質粒PGL3-enchancer,與 PRL-TK共轉染shFOXQ1-DLD1 和 shcontrol-DLD1細胞,檢測熒光強度改變以確定FOXQ1是否直接轉錄激活這五個基因。結果：分別成功構建了含HBEGF、PDGFβ、PDGFRβ、PLAT、IL1β 5個基因啟動子區(qū)域的螢火蟲熒光質粒,證明在大腸癌細胞DLD1 中 FOXQ1并未直接靶向激活HBEGF、PDGFβ、PDGFRβ、PLAT、IL1β基因的轉錄。結論：FOXQ1未直接轉錄激活HBEGF、PDGFβ、PDGFRβ、PLAT、IL1β 5個基因。
【關鍵詞】：基因芯片 叉頭框蛋白Q1 癌基因 雙熒光素酶報告系統(tǒng)
【學位授予單位】：昆明理工大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R735.35
【目錄】：

• 摘要6-8
• ABSTRACT8-13
• 第一章 緒論13-21
• 1.1 結腸癌的流行病學知識13-14
• 1.2 FOX轉錄因子基因家族14-15
• 1.3 FOXQ1基因研究現(xiàn)狀15-16
• 1.4 上皮間質轉化和FOXQ116-18
• 1.5 大腸癌中的FOXQ1基因研究18-19
• 1.6 本實驗總體設計思路19
• 1.7 實驗流程19-21
• 第二章 實驗材料和儀器21-23
• 材料21-22
• 儀器22-23
• 第三章 實驗內容23-100
• 第一部分 利用基因芯片探究FOXQ1在結腸癌中的作用23-72
• 1.1 實驗過程23-35
• 1.1.1 RNA的獲取23
• 1.1.2 QRT-PCR進行驗證FOXQ1敲低效率23-25
• 1.1.3 Western blot驗證FOXQ1蛋白表達量差異25-30
• 1.1.4 芯片樣本準備與芯片雜交30-32
• 1.1.5 芯片掃描與結果分析32
• 1.1.6 芯片結果的驗證32-35
• 1.2 結果35-69
• 1.2.1 FOXQ1敲低效率驗證35
• 1.2.2 RNA質量驗證35-36
• 1.2.3 mRNA芯片測定的基因表達量差異原始數(shù)據(jù)36-39
• 1.2.4 mRNA芯片GO分析39-51
• 1.2.5 mRNA芯片Pathway分析51-54
• 1.2.6 伴隨FOXQ1敲低,microRNA的表達改變54-55
• 1.2.7 MicroRNA芯片的GO分析55-66
• 1.2.8 MicroRNA下調,mRNA上調結果關聯(lián)分析66-67
• 1.2.9 MicroRNA上調,mRNA下調結果交聯(lián)分析67-68
• 1.2.10 芯片結果qRT-PCR驗證結果68-69
• 1.3 討論69-72
• 1.3.1 片技術討論69-70
• 1.3.2 FOXQ1相關基因的聚類分析和功能探究70-71
• 1.3.3 FOXQ1相關microRNA功能分析71-72
• 第二部分 利用雙熒光素酶報告系統(tǒng)探究FOXQ1在結腸癌中直接轉錄激活的靶基因72-100
• 2.1 實驗過程72-82
• 2.1.1 啟動子結合位點預測72
• 2.1.2 螢火蟲熒光素酶質粒的構建72-80
• 2.1.3 細胞轉染和熒光檢測80-82
• 2.2 實驗結果82-93
• 2.2.1 獲取啟動子區(qū)域序列信息82
• 2.2.2 利用JASPAR預測結果82-84
• 2.2.3 五個基因PCR擴增結果84-86
• 2.2.4 五個基因測序的結果86-92
• 2.2.5 熒光素酶報告系統(tǒng)檢測熒光強度92-93
• 2.3 討論93-100
• 2.3.1 轉錄機制研究的重要意義93
• 2.3.2 JASPAR數(shù)據(jù)庫93-94
• 2.3.3 雙熒光素酶報告系統(tǒng)94-98
• 2.3.4 五個基因的選取依據(jù)98-99
• 2.3.5 實驗失敗原因分析99-100
• 第四章 結論100-101
• 參考文獻101-106
• 附錄106-108
• 附錄A：攻讀學位其間發(fā)表論文目錄106
• 附錄B：攻讀學位其間參與科研項目106-107
• 附錄C：部分詞匯縮寫中英文對照表107-108
• 附件108-119
• 致謝119

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1 白璇;唐慧;郎豐超;郭強;;慢病毒表達載體的構建及沉默F(xiàn)OXQ1基因在大腸癌細胞系DLD-1中的表達[J];世界華人消化雜志;2014年19期

中國碩士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 彭旭東;FOXQ1基因在大腸癌SW480細胞的EMT中的作用[D];重慶醫(yī)科大學;2015年

2 鄭極;應用表達譜芯片和熒光素酶報告系統(tǒng)篩選并鑒定大腸癌FOXQ1基因的潛在下游靶基因[D];昆明理工大學;2016年

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本文編號：758567