本文關(guān)鍵詞：蛇床子三螺旋轉(zhuǎn)錄因子基因的克隆、表達(dá)、純化及生物信息學(xué)分析

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【摘要】：1目的對中藥蛇床子(Cnidium monnieri(L.)Cuss.)三螺旋轉(zhuǎn)錄因子(Trihelix Transcription Factor,ttf)基因進(jìn)行克隆,并且誘導(dǎo)其在大腸桿菌BL21中表達(dá),表達(dá)得到的目的蛋白進(jìn)一步通過鎳柱進(jìn)行純化,并利用生物信息學(xué)方法分析和預(yù)測該蛋白的可能的結(jié)構(gòu)和各項生物學(xué)性質(zhì)。2方法采用總RNA提取試劑盒提取蛇床子植物的總RNA,再逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA,以后者為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增目的基因,將純化得到的目的基因連接到pMD19-T克隆載體中,PCR及酶切鑒定后將得到陽性結(jié)果的目的基因與T載體的重組質(zhì)粒送樣測序。核酸測序鑒定正確后再將目的基因克隆到pET-22b(+)表達(dá)載體上,將所得的重組質(zhì)粒再次作酶切和測序鑒定。將獲得的正確的重組質(zhì)粒ttf-pET-22b(+)轉(zhuǎn)化到大腸桿菌E.coli BL21細(xì)胞中,以不同濃度的誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)其表達(dá),進(jìn)一步利用聚丙烯酰胺凝膠電泳和免疫印跡方法檢測目的蛋白的表達(dá)情況,篩選得到最佳的表達(dá)條件,并進(jìn)一步在大腸桿菌中大量表達(dá),破碎菌體,收集上清中表達(dá)的蛋白,利用鎳親和柱進(jìn)行純化;通過Protparam、InterProScan、ExPASy、Coils、SmartBlast等各種生物學(xué)軟件進(jìn)行目的蛋白氨基酸序列比對、各種活性位點和結(jié)構(gòu)域分析、結(jié)構(gòu)預(yù)測、進(jìn)化分析。3結(jié)果本研究首次成功地將蛇床子三螺旋轉(zhuǎn)錄因子基因克隆到了原核表達(dá)載體,利用IPTG進(jìn)行誘導(dǎo),目的基因得到了成功表達(dá)。Western-blotting結(jié)果表明,0.1mmol/l IPTG誘導(dǎo)表達(dá)蛋白效果最好,37℃條件下表達(dá)量較多。利用Protparam軟件我們得知TTF蛋白含有179個氨基酸殘基、理論分子質(zhì)量為21254.7u,等電點為7.85;為可溶性蛋白,但在溶液中不穩(wěn)定。利用Motif Scan我們分析了該蛋白質(zhì)的各種基元,包括各種活性位點和結(jié)構(gòu)域;PSORT預(yù)測了該蛋白質(zhì)主要定位于細(xì)胞核和線粒體中;Predict Protein預(yù)測該蛋白質(zhì)中規(guī)則的二級結(jié)構(gòu)主要是卷曲螺旋,Coils軟件預(yù)測E116-R142、R144-A163兩段區(qū)域形成卷曲螺旋的可能性極大,根據(jù)NCBI的比對結(jié)果進(jìn)行進(jìn)化分析表明TTF基因與芝麻的親緣關(guān)系最近。4結(jié)論1,在國際上首次體外成功克隆了蛇床子三螺旋轉(zhuǎn)錄因子ttf基因,并篩選得到了克隆該基因最佳PCR條件。2,成功構(gòu)建了ttf基因的克隆重組質(zhì)粒ttf-pMD19-T和表達(dá)重組質(zhì)粒ttfpET22b(+)。3,將表達(dá)重組質(zhì)粒ttf-pET22b(+)轉(zhuǎn)化進(jìn)BL21大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中,在IPTG誘導(dǎo)下得到了很好的表達(dá),在37度環(huán)境下,0.1mmol/L的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)的蛋白量最多。4,對TTF蛋白進(jìn)行了系統(tǒng)的生物信息學(xué)分析,為進(jìn)一步研究其結(jié)構(gòu)和功能奠定了基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：蛇床子 三螺旋轉(zhuǎn)錄因子 基因克隆 蛋白質(zhì)表達(dá) 生物信息學(xué)
【學(xué)位授予單位】：安徽中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S567.239;Q943.2
【目錄】：

• 中文摘要6-8
• 英文摘要8-10
• 英文縮略詞表10-11
• 前言11-13
• 第一章 蛇床子三螺旋轉(zhuǎn)錄因子ttf基因的克隆13-32
• 1 實驗材料13-14
• 1.1 實驗菌種和植物13
• 1.2 實驗儀器13-14
• 1.3 實驗試劑14
• 2 實驗方法14-24
• 2.1 蛇床子總RNA的提取14-16
• 2.2 逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA16
• 2.3 PCR擴(kuò)增目的基因ttf16-19
• 2.4 膠回收目的基因19
• 2.5 目的基因與克隆載體pMD-19的連接19-20
• 2.6 感受態(tài)細(xì)胞的制備實驗20-21
• 2.7 感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化實驗21-22
• 2.8 抽提重組質(zhì)粒實驗22-23
• 2.9 重組子雙酶切實驗23-24
• 3 實驗結(jié)果24-31
• 4 實驗結(jié)論31-32
• 第二章 蛇床子三螺旋轉(zhuǎn)錄因子ttf基因的表達(dá)與純化32-45
• 1 實驗材料32-33
• 1.1 實驗儀器32-33
• 1.2 實驗試劑33
• 2 實驗方法33-38
• 2.1 表達(dá)載體的構(gòu)建實驗33-34
• 2.2 目的基因的誘導(dǎo)表達(dá)34-37
• 2.3 目的蛋白的純化37-38
• 3 實驗結(jié)果38-42
• 3.1 表達(dá)載體pET-22b與目的基因的連接38-39
• 3.2 聚丙烯酰胺凝膠電泳SDS-PAGE39-42
• 4 免疫印跡法western-blot42-43
• 5 實驗結(jié)論43-45
• 第三章蛇床子三螺旋轉(zhuǎn)錄因子ttf基因的生物信息學(xué)分析45-54
• 3.1 目的基因核苷酸序列分析45-46
• 3.2 三螺旋轉(zhuǎn)錄因子蛋白理化性質(zhì)分析46-48
• 3.3 目的蛋白TTF的基序、結(jié)構(gòu)域和定位的分析48-50
• 3.4 三螺旋轉(zhuǎn)錄因子TTF同源性序列比對和進(jìn)化分析50-52
• 3.5 目的蛋白的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測和溶劑的溶解性分析52-53
• 3.6 本章小結(jié)53-54
• 綜述54-58
• 參考文獻(xiàn)58-64
• 個人簡介64
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表論文情況64-65
• 致謝65

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