本文關鍵詞：蛇床子三螺旋轉錄因子基因的克隆、表達、純化及生物信息學分析

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【摘要】：1目的對中藥蛇床子(Cnidium monnieri(L.)Cuss.)三螺旋轉錄因子(Trihelix Transcription Factor,ttf)基因進行克隆,并且誘導其在大腸桿菌BL21中表達,表達得到的目的蛋白進一步通過鎳柱進行純化,并利用生物信息學方法分析和預測該蛋白的可能的結構和各項生物學性質。2方法采用總RNA提取試劑盒提取蛇床子植物的總RNA,再逆轉錄得到cDNA,以后者為模板進行PCR擴增目的基因,將純化得到的目的基因連接到pMD19-T克隆載體中,PCR及酶切鑒定后將得到陽性結果的目的基因與T載體的重組質粒送樣測序。核酸測序鑒定正確后再將目的基因克隆到pET-22b(+)表達載體上,將所得的重組質粒再次作酶切和測序鑒定。將獲得的正確的重組質粒ttf-pET-22b(+)轉化到大腸桿菌E.coli BL21細胞中,以不同濃度的誘導劑誘導其表達,進一步利用聚丙烯酰胺凝膠電泳和免疫印跡方法檢測目的蛋白的表達情況,篩選得到最佳的表達條件,并進一步在大腸桿菌中大量表達,破碎菌體,收集上清中表達的蛋白,利用鎳親和柱進行純化;通過Protparam、InterProScan、ExPASy、Coils、SmartBlast等各種生物學軟件進行目的蛋白氨基酸序列比對、各種活性位點和結構域分析、結構預測、進化分析。3結果本研究首次成功地將蛇床子三螺旋轉錄因子基因克隆到了原核表達載體,利用IPTG進行誘導,目的基因得到了成功表達。Western-blotting結果表明,0.1mmol/l IPTG誘導表達蛋白效果最好,37℃條件下表達量較多。利用Protparam軟件我們得知TTF蛋白含有179個氨基酸殘基、理論分子質量為21254.7u,等電點為7.85;為可溶性蛋白,但在溶液中不穩(wěn)定。利用Motif Scan我們分析了該蛋白質的各種基元,包括各種活性位點和結構域;PSORT預測了該蛋白質主要定位于細胞核和線粒體中;Predict Protein預測該蛋白質中規(guī)則的二級結構主要是卷曲螺旋,Coils軟件預測E116-R142、R144-A163兩段區(qū)域形成卷曲螺旋的可能性極大,根據NCBI的比對結果進行進化分析表明TTF基因與芝麻的親緣關系最近。4結論1,在國際上首次體外成功克隆了蛇床子三螺旋轉錄因子ttf基因,并篩選得到了克隆該基因最佳PCR條件。2,成功構建了ttf基因的克隆重組質粒ttf-pMD19-T和表達重組質粒ttfpET22b(+)。3,將表達重組質粒ttf-pET22b(+)轉化進BL21大腸桿菌感受態(tài)細胞中,在IPTG誘導下得到了很好的表達,在37度環(huán)境下,0.1mmol/L的IPTG誘導表達的蛋白量最多。4,對TTF蛋白進行了系統(tǒng)的生物信息學分析,為進一步研究其結構和功能奠定了基礎。
【關鍵詞】：蛇床子 三螺旋轉錄因子 基因克隆 蛋白質表達 生物信息學
【學位授予單位】：安徽中醫(yī)藥大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S567.239;Q943.2
【目錄】：

• 中文摘要6-8
• 英文摘要8-10
• 英文縮略詞表10-11
• 前言11-13
• 第一章 蛇床子三螺旋轉錄因子ttf基因的克隆13-32
• 1 實驗材料13-14
• 1.1 實驗菌種和植物13
• 1.2 實驗儀器13-14
• 1.3 實驗試劑14
• 2 實驗方法14-24
• 2.1 蛇床子總RNA的提取14-16
• 2.2 逆轉錄合成cDNA16
• 2.3 PCR擴增目的基因ttf16-19
• 2.4 膠回收目的基因19
• 2.5 目的基因與克隆載體pMD-19的連接19-20
• 2.6 感受態(tài)細胞的制備實驗20-21
• 2.7 感受態(tài)細胞的轉化實驗21-22
• 2.8 抽提重組質粒實驗22-23
• 2.9 重組子雙酶切實驗23-24
• 3 實驗結果24-31
• 4 實驗結論31-32
• 第二章 蛇床子三螺旋轉錄因子ttf基因的表達與純化32-45
• 1 實驗材料32-33
• 1.1 實驗儀器32-33
• 1.2 實驗試劑33
• 2 實驗方法33-38
• 2.1 表達載體的構建實驗33-34
• 2.2 目的基因的誘導表達34-37
• 2.3 目的蛋白的純化37-38
• 3 實驗結果38-42
• 3.1 表達載體pET-22b與目的基因的連接38-39
• 3.2 聚丙烯酰胺凝膠電泳SDS-PAGE39-42
• 4 免疫印跡法western-blot42-43
• 5 實驗結論43-45
• 第三章蛇床子三螺旋轉錄因子ttf基因的生物信息學分析45-54
• 3.1 目的基因核苷酸序列分析45-46
• 3.2 三螺旋轉錄因子蛋白理化性質分析46-48
• 3.3 目的蛋白TTF的基序、結構域和定位的分析48-50
• 3.4 三螺旋轉錄因子TTF同源性序列比對和進化分析50-52
• 3.5 目的蛋白的二級結構預測和溶劑的溶解性分析52-53
• 3.6 本章小結53-54
• 綜述54-58
• 參考文獻58-64
• 個人簡介64
• 攻讀學位期間發(fā)表論文情況64-65
• 致謝65

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