本文關(guān)鍵詞：陜北黃芥黃籽基因的精細定位及候選基因表達載體的構(gòu)建

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【摘要】：油菜是世界上最主要的油料作物之一,是重要的食用油、飼料蛋白和工業(yè)能源作物。提高油菜種子含油量和品質(zhì)育種一直是育種家研究的重要課題。大量研究表明,在相同的遺傳背景下,黃籽油菜的含油量一般高于褐籽、黑籽,且黃籽油菜具有種皮薄、油清澈透明、蛋白質(zhì)含量高等優(yōu)點。然而目前廣泛栽培的甘藍型油菜中卻沒有天然的黃籽種質(zhì),育種家通過對芥菜型、白菜型油菜中黃籽材料遺傳特性以及黃籽形成機理等的研究,希望通過遠緣雜交、黃籽基因?qū)氲扰嘤瞿軌蚍�(wěn)定遺傳黃籽性狀的甘藍型黃籽油菜。陜北黃芥黃籽性狀多表現(xiàn)為純黃且遺傳穩(wěn)定,遺傳模式較為簡單,是研究黃籽基因的理想材料。本研究選用陜北吳旗地方品種——吳旗黃芥為主要研究材料,在前期研究的基礎(chǔ)上,對吳旗黃芥和關(guān)中褐芥構(gòu)建的BC6S1群體進行表型鑒定和遺傳分析、黃籽基因精細定位、候選基因分析以及對候選基因構(gòu)建超表達載體、沉默載體四方面的研究,以期進一步明確陜北黃芥黃籽性狀形成的分子機制,為克隆黃籽基因進行轉(zhuǎn)基因育種提供理論支撐。研究結(jié)果如下:1.表型鑒定和遺傳分析:以吳旗黃芥為輪回親本,關(guān)中褐芥為供體親本構(gòu)建1216個單株的BC6S1分離群體為分析群體,通過對BC6S1衍生的BC6S2、BC6S3連續(xù)兩代單株種皮色觀察,分析鑒定BC6S1群體種皮色基因型分配,結(jié)果在1216個BC6S1群體中,有純合黃籽293株,純合褐籽307株,雜合褐籽616株�？ǚ綔y驗說明,黃/褐籽基因型分配符合1:2:1(χ2=0.22,p≤0.05)。此結(jié)果進一步證明陜北黃芥的黃籽性狀受1對等位基因控制,褐籽對黃籽為顯性。2.黃籽基因的精細定位:前人研究已將陜北黃芥的黃籽基因定位于A09染色體,本研究在其基礎(chǔ)上,擴大群體為1216個單株,設(shè)計多態(tài)性引物63對,成功開發(fā)10個標記,其中IP標記5個、SCAR標記5個。構(gòu)建了遺傳連鎖圖譜,其中距離基因最近的兩個標記IP4和Y1,位于基因的兩側(cè),遺傳距離分別是0.1和0.3cM;IP1、IP2、IP3標記與黃籽基因共分離,將距離黃籽基因較近的分子標記序列和白菜A基因組進行比對分析發(fā)現(xiàn)黃籽基因在A09連鎖群27.079~27.616M范圍內(nèi)(約0.54Mb)。3.黃籽候選基因分析:對上述0.54Mb區(qū)域的95個基因進行結(jié)構(gòu)分析和功能預測,結(jié)果表明僅有Bra036828基因與類黃酮合成途徑相關(guān),Bra036828基因和擬南芥F3H基因高度同源,因此初步確定Bra036828基因(芥菜型中命名為BjF3H-b1)為候選基因�？寺￡P(guān)中褐芥BjF3H-b1基因的CDS序列,序列全長1077bp,編碼358個氨基酸。4.構(gòu)建超表達載體和沉默載體:對已經(jīng)克隆的BjF3H-b1基因,進行兩次擴增得到目的基因片段,利用快速連接酶對表達載體pCAMBIA1301和擴增產(chǎn)物進行連接,并將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α,篩選到含有目的基因的重組質(zhì)粒,成功構(gòu)建了候選基因Bj F3H-b1的超表達載體BjF3H-b1-1301和RNAi沉默表達載體silence2-1301,PCR和酶切檢測驗證重組子,并將驗證后的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌感受態(tài)GV3101菌液中,完成表達載體的構(gòu)建。
【關(guān)鍵詞】：芥菜型油菜 黃籽 分子標記 精細定位 候選基因 載體構(gòu)建
【學位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S565.4
【目錄】：

• 摘要5-7
• ABSTRACT7-11
• 第一章 文獻綜述11-23
• 1.1 黃籽油菜的研究進展11-17
• 1.1.1 種皮顏色與油菜其他性狀的相關(guān)性11-12
• 1.1.2 油菜種皮顏色的遺傳研究12
• 1.1.3 油菜黃籽基因的定位12-14
• 1.1.4 油菜黃籽形成的機理研究14-17
• 1.2 圖位克隆技術(shù)在油菜黃籽中應(yīng)用17-20
• 1.2.1 分子標記技術(shù)在基因定位中的應(yīng)用17-18
• 1.2.2 油菜黃籽基因的精細定位研究18-20
• 1.3 候選基因功能分析方法20-22
• 1.3.1 RNA干涉原理與應(yīng)用20-21
• 1.3.2 超表達技術(shù)的應(yīng)用21
• 1.3.3 遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)的應(yīng)用21-22
• 1.4 本研究的目的和意義22-23
• 第二章 陜北黃芥黃籽基因的精細定位23-31
• 2.1 材料和方法23-25
• 2.1.1 試驗材料23-24
• 2.1.2 試驗方法24-25
• 2.2 結(jié)果與分析25-29
• 2.2.1 BC_6S_1群體種皮色基因型鑒定25
• 2.2.2 標記的開發(fā)與遺傳圖譜的構(gòu)建25-28
• 2.2.3 序列分析及候選基因的確定28-29
• 2.3 討論29-31
• 2.3.1 候選基因確定策略29
• 2.3.2 擬南芥標記的開發(fā)29-30
• 2.3.3 IP 標記的開發(fā)30-31
• 第三章 黃籽候選基因的表達載體構(gòu)建及遺傳轉(zhuǎn)化研究31-43
• 3.1 試驗材料31
• 3.2 試驗方法31-34
• 3.3 結(jié)果與分析34-41
• 3.3.1 RNA、cDNA質(zhì)量34-35
• 3.3.2 Bj F3H-b1 基因克隆結(jié)果與分析35-37
• 3.3.3 BjF3H-b1基因植物表達載體構(gòu)建結(jié)果37-38
• 3.3.4 silence2-1301植物表達載體構(gòu)建結(jié)果38-41
• 3.4 討論41-43
• 3.4.1 BjF3H-b1-1301載體的構(gòu)建41-42
• 3.4.2 silence2-1301載體的構(gòu)建42
• 3.4.3 F3H基因研究進展42-43
• 第四章 全文總結(jié)43-44
• 4.1 全文結(jié)論43
• 4.2 試驗下一步計劃43-44
• 參考文獻44-50
• 附錄50-58
• 致謝58-59
• 作者簡介59

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本文編號：751884